自噬是真核生物细胞中一种进化保守的生理过程,在这过程中,自噬相关基因ATG6编码的蛋白可以形成磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）复合体I,以此调控自噬过程的发生和自噬小体的形成。拟南芥、烟草、水稻和小麦中的功能研究表明,ATG6同源蛋白及其具有的自噬功能与植物体抗胁迫和病原菌侵染引起的免疫反应密切相关,此外,拟南芥AtATG6基因的突变还会导致花粉不能萌发。因此,ATG6蛋白的功能研究不但能促进对植物自噬分子机制的认识,而且可以应用于调控植物生长发育及改良抗胁迫性能。本研究以大麦为材料,在其基因组中搜索自噬相关的同源ATG6功能蛋白（HvATG6）,通过基因克隆,序列结构分析,亚细胞定位,酵母功能互补,表达谱分析和基因瞬时沉默试验,初步证明该蛋白具自噬相关的功能,且与大麦抗胁迫之间具有关联性。具体实验结果如下：1大麦ATG6蛋白的筛选和序列分析以拟南芥和水稻的ATG6蛋白序列为参照,在大麦数据库中进行同源性搜索,筛选得到大麦中的ATG6同源蛋白,命名为HvATG6 （Ensemble plants数据库中基因编号为MLOC₇1271）。通过序列比对、功能结构域搜索和进化树分析,发现HvATG6与其他植物特别是小麦,水稻的ATG6同源蛋白序列相似度分别达到了90%和70%以上,HvATG6蛋白中也含有相应的β-折叠-α-螺旋自噬功能结构域,暗示着该蛋白可发挥自噬功能。2 HvATG6蛋白的细胞学定位和功能分析2.1 HvATG6蛋白定位于细胞质中在大麦原生质体中转化并表达N端GFP融合的HvATG6蛋白,发现HvATG6蛋白定位在细胞质中,并且能形成类似于自噬小体前体（Pre-autophagosomal structure, PAS）的点状结构,说明其可能在大麦细胞中发挥自噬功能。2.2 HvATG6能够互补酵母atg6突变体中的自噬功能缺陷将HvATG6蛋白在酵母atg6突变体细胞中表达,在氮源营养缺陷条件下处理后,发现该酵母突变体可以重新出现类似自噬小体的结构,说明HvATG6蛋白可以弥补酵母细胞因其ATG6基因突变引起的自噬缺陷,亦即HvATG6同源蛋白在酵母细胞中仍可以发挥其相应的自噬功能。3HvATG6基因在多种非生物胁迫条件下表达上调野生型大麦在高盐、干旱、冷、氮源缺陷和铝处理等多种非生物胁迫条件下,幼苗中HvATG6基因表达水平与对照相比明显上调。其中,在铝毒胁迫下HvATG6基因的表达变化最为显著,铝敏感品种GP（Golden Promise）幼苗分别在10μM或30 μM Al3+处理72 h的结果表明,根中HvATG6的基因表达水平均为正常培养幼苗根中的4倍以上,10 μM Al3+胁迫处理4h后还发现,HvATG6基因只在根尖处有比较明显的上调表达,而这种变化在不同铝敏感大麦品种之间有着明显的差异。这些均表明HvATG6基因的表达与大麦胁迫反应密切相关,同时也符合自噬过程能帮助植物抵抗外界胁迫环境的功能特征。4 HvATG6基因瞬时沉默的大麦株系对胁迫环境的敏感性增强通过大麦条纹花叶病毒（Barley strip mosaic virus, BSMV）介导的叶片基因沉默实验,得到了在大麦新生叶片中ATG6基因表达水平明显下降的植株。接着在黑暗条件或者氧化胁迫中分别处理后发现,与对照组相比,ATG6基因表达下调的植株离体叶片出现更强程度的黄化或者衰老现象,这表明HvATG6基因的沉默削弱了大麦叶片的抗胁迫能力,进而使其对胁迫环境的敏感性增强,这亦符合植物自噬基因缺陷后的功能特征。总之,研究证明大麦中确也存在一个类似的ATG6自噬同源蛋白,该蛋白定位于细胞质中,具有相关的自噬功能。HvATG6的基因表达与多种胁迫有关,通过调控其表达来改良大麦的抗胁迫能力将会起到重要的作用,亦为进一步深入探究HvATG6的生物学功能奠定基础。