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背景脓毒症是临床上发病凶险和致死率高的常见并发症。内毒素耐受是机体应对脓毒症的一种重要的内源性保护途径。丙酮酸激酶M2（pyruvate kinase M2,PKM2）是糖酵解途径的限速酶,PKM2有三种构型:单聚体、二聚体和四聚体。研究发现单核巨噬细胞在脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）的刺激下,促进PKM2四聚体（位于胞浆）向单/二聚体（位于胞核）转变,通过诱导单/二聚体PKM2的核转位,介导炎症反应。TEPP-46是PKM2的小分子激动剂,可以诱导PKM2四聚体形成。研究表明用TEPP-46处理的单核巨噬细胞通过抑制单/二聚体PKM2的核转位抑制LPS介导的炎症反应。TEPP-46除了可以抑制单/二聚体PKM2核转位,还可以促进PKM2四聚体形成。四聚体的PKM2对巨噬细胞内毒素耐受有何调控作用以及调控的具体分子机制是什么,目前尚不清楚。研究PKM2四聚体在巨噬细胞内毒素耐受中的作用机理,对阐明脓毒症时内源性保护效应具有重要意义。在本研究中,我们以C57BL/6小鼠、小鼠腹腔巨噬细胞（peritoneal macrophage,PMs）、小鼠肝脏枯否细胞（Kupffer cells,KCs）以及RAW264.7巨噬细胞株为研究对象,以PKM2为研究靶点,通过用不同浓度LPS刺激的方式构建小鼠或巨噬细胞内毒素耐受和非耐受模型,探讨PKM2在内毒素耐受形成中的作用及分子机制。这为进一步研究内毒素耐受的分子机制以及研究脓毒症时机体的内源性保护途径提供了新的理论依据。第一部分:PKM2四聚体对巨噬细胞内毒素耐受的影响目的:探讨PKM2四聚体在体内/外对小鼠PMs和肝脏KCs以及RAW264.7巨噬细胞内毒素耐受的调控作用。方法:（1）用腹腔注射不同剂量LPS的方式构建小鼠内毒素耐受和非耐受模型,提取各组小鼠的PMs和KCs,Western blot实验和细胞免疫荧光实验检测内毒素耐受和非耐受小鼠PMs和KCs中PKM2蛋白表达;ELISA实验检测小鼠血清中肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）和白细胞介素6（imerleukin-6,IL6）的水平。（2）提取正常小鼠PMs和KCs,用不同浓度LPS刺激,构建PMs、KCs和RAW264.7细胞内毒素耐受和非耐受模型,检测细胞中PKM2蛋白表达;ELISA实验检测细胞上清液中TNF-α和IL6的水平。（3）TEPP-46是PKM2的小分子激动剂,可以促进PKM2四聚体的表达。Western blot实验探索TEPP-46的最佳刺激浓度和最佳处理时间;CCK8实验检测TEPP-46对RAW264.7细胞活性的影响。（4）用TEPP-46诱导RAW264.7细胞PKM2四聚体的形成,再用大剂量LPS处理细胞,ELISA实验检测细胞上清液中炎症因子的水平,探讨TEPP-46诱导的PKM2四聚体形成对巨噬细胞内毒素耐受的影响。结果:（1）在体内,与内毒素非耐受组（脓毒症组）小鼠相比,内毒素耐受组小鼠PMs和KCs中PKM2四聚体表达升高,单/二聚体表达降低,抑制了LPS介导的PKM2核转位;内毒素耐受组小鼠血清中炎症因子TNF-α和IL6的水平更低,差异具有统计学意义（p<0.05）。（2）在体外,与内毒素非耐受组的PMs、KCs和RAW264.7细胞相比,内毒素耐受组PMs、KCs和RAW264.7细胞中PKM2四聚体表达升高,单/二聚体表达降低（p<0.05）,同样抑制LPS介导的PKM2核转位;内毒素耐受组细胞上清液中炎症因子TNF-α和IL6的水平更低（p<0.05）。（3）TEPP-46促进巨噬细胞PKM2四聚体形成,在50 nmol/ml的TEPP-46刺激2 h时巨噬细胞中PKM2四聚体的蛋白表达接近峰值;CCK8实验证实50 nmol/ml的TEPP-46刺激2h对巨噬细胞无明显毒性作用（p>0.05）。（4）用50 nmol/ml的TEPP-46预刺激RAW264.7细胞2 h,再用大剂量LPS处理,发现TEPP-46预处理可以显著降低LPS介导的炎症因子TNF-α和IL6的分泌（p<0.05）,诱导巨噬细胞内毒素耐受。结论:巨噬细胞内毒素耐受促进PKM2四聚体的高表达,而PKM2四聚体的形成也是巨噬细胞内毒素耐受的关键环节。第二部分:TEPP-46介导的PKM2四聚体形成调控巨噬细胞内毒素耐受的分子机制目的:探讨TEPP-46介导的PKM2四聚体形成调控巨噬细胞内毒素耐受的分子机制。方法:首先,探讨TEPP-46介导的PKM2四聚体形成对线粒体功能的影响。（1）用50 nmol/ml的TEPP-46刺激RAW264.7细胞2 h后,流式检测细胞对壬基吖啶橙染剂（nonyl acridine orange,NAO）的摄取;Western blot检测细胞中p62、LC3和线粒体转录因子A（mitochondrial transcription factor A,mtTFA）的蛋白表达;RT-PCR实验检测线粒体DNA（mitochondrial DNA,mtDNA）的相对拷贝数;透射电镜检测细胞的大体形态改变;线粒体压力测试实验检测细胞耗氧率（oxygen consumption rate,OCR）、基础呼吸、ATP产生和最大呼吸等。（2）接着用小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）沉默细胞PKM2基因后,再重复上述实验。（3）用短发夹RNA（short hairpin RNA,shRNA）沉默细胞mtTFA基因,通过重复上述实验,探讨细胞线粒体生物合成对PKM2四聚体诱导的巨噬细胞内毒素耐受的调控作用。（4）用shRNA沉默细胞PGC-1α基因,重复上述实验,探讨PGC-1α在PKM2四聚体诱导的线粒体生物合成中的调控作用。（5）用PI3K小分子激动剂740Y-P或Akt小分子激动剂SC79刺激细胞,通过Western blot实验检测磷酸化PI3K（phosphorylation of PI3K,p-PI3K）、PI3K、p-Akt和Akt的蛋白表达,探讨PI3K/Akt信号通路在PKM2四聚体促进PGC-1α表达中的调控作用。结果:（1）50 nmol/ml的TEPP-46刺激RAW264.7细胞2 h,细胞对NAO的摄取显著增加（p<0.05）,说明TEPP-46介导的PKM2四聚体形成促进巨噬细胞线粒体质量的增加;此外,TEPP-46增加巨噬细胞mtDNA的相对拷贝数（p<0.05）,也促进mtTFA的蛋白表达（p<0.05）,电镜结果显示TEPP-46刺激细胞后,线粒体数量增多（p<0.05）,以上结果说明TEPP-46介导的PKM2四聚体形成促进巨噬细胞线粒体生物合成;TEPP-46对巨噬细胞中p62和LC3BI/II的蛋白表达无显著影响（p>0.05）,电镜结果显示细胞内溶酶体数量无显著变化（p>0.05）,提示TEPP-46介导的PKM2四聚体形成对巨噬细胞自噬和线粒体自噬水平无显著影响;TEPP-46刺激细胞后提高了巨噬细胞OCR,同时也提高了基础呼吸率、ATP产生和最大呼吸,说明TEPP-46介导的PKM2四聚体形成促进了巨噬细胞的呼吸功能（p<0.05）。（2）用siRNA沉默细胞PKM2后,发现沉默PKM2后,TEPP-46对线粒体生物合成和OCR的促进作用减弱甚至消失,提示TEPP-46的上述功能依赖于PKM2;（3）通过沉默细胞mtTFA的方式抑制线粒体生物合成后,有效抑制了PKM2四聚体诱导的巨噬细胞内毒素耐受;（4）PKM2四聚体通过促进PGC-1α的表达促进线粒体生物合成,用慢病毒抑制细胞PGC-1α的表达后,PKM2四聚体对巨噬细胞线粒体生物合成的促进作用减弱;（5）TEPP-46介导的PKM2四聚体形成通过抑制PI3K/Akt信号通路的激活,促进PGC-1α的表达。用PI3K小分子激动剂740Y-P或Akt小分子激动剂SC79刺激细胞后,显著抑制了PKM2四聚体对PGC-1α的促进作用（p<0.05）。结论:TEPP-46介导的PKM2四聚体形成通过抑制PI3K/Akt信号通路的激活,促进PGC-1α的表达,通过诱导巨噬细胞线粒体生物合成,抑制LPS介导的炎症因子TNF-α和IL6的释放,进而促进巨噬细胞内毒素耐受。第三部分:TEPP-46介导的PKM2四聚体形成对脓毒症小鼠内毒素耐受的调控作用目的:探讨TEPP-46介导的PKM2四聚体形成在体内对脓毒症小鼠内毒素耐受的调控作用。方法:（1）首先通过腹腔注射的方式将50 mg/kg的TEPP-46注入C57BL/6小鼠体内,再提取小鼠PMs和KCs,Western blot实验检测细胞中PKM2的蛋白表达;流式细胞仪检测了细胞对NAO的摄取;RT-PCR实验检测mtDNA的相对拷贝数。（2）用腹腔注射5 mg/kg LPS的方式或用盲肠结扎穿孔术（cecal ligation and puncture,CLP）构建小鼠脓毒症模型,联合腹腔注射50 mg/kg的TEPP-46,通过观察小鼠生存率、ELISA实验检测小鼠血清中炎症因子的水平以及HE染色检测肝组织的病理改变,探讨TEPP-46在体内对脓血症小鼠内毒素耐受的影响及调控作用。（3）通过尾静脉向小鼠体内注射氯磷酸二钠脂质体（clodronate liposomes,CL）清除小鼠体内的单核/巨噬细胞,再用腹腔注射LPS的方式构建小鼠脓毒症模型,联合腹腔注射50 mg/kg的TEPP-46,通过检测血清中炎症因子的水平,探讨单核/巨噬细胞在TEPP-46诱导的小鼠内毒素耐受中的作用。结果:（1）在体内,TEPP-46促进小鼠PMs和KCs中PKM2四聚体表达,并通过促进PGC-1α、核呼吸因子1/2（nuclear respiratory factor,NRF1/2）和mtTFA的表达,诱导巨噬细胞线粒体生物合成;（2）TEPP-46有效抑制脓毒症小鼠炎症因子TNF-α和IL6的分泌,延长小鼠的生存时间（p<0.05）;（3）尾静脉注射CL可有效清除小鼠PMs和KCs（p<0.05）。清除小鼠PMs和KCs后,抑制了TEPP-46诱导的脓毒症小鼠内毒素耐受。结论:在小鼠体内,TEPP-46通过介导小鼠单核/巨噬细胞PKM2四聚体形成,诱导线粒体生物合成,进而促进小鼠内毒素耐受。