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退行性骨关节炎（degenerative osteoarthritis OA）病因尚未完全明了,目前认为是多因素致病,临床上采用医用臭氧（O3）关节腔内注射治疗早-中期OA取得了较好的疗效,但O3的作用效应及其治疗机理目前仍不甚明了,本实验采用Hulth模型造模后,在兔膝关节腔内注射臭氧（O3）,探讨O3抑制软骨细胞退变作用效应及机理,为医用O3治疗早-中期OA提供实验支持。一、O3对关节软骨的病理改变的影响目的：观察O3对Hulth模型OA软骨光镜下改变的影响。方法：32只兔随机分为2组,分别为治疗组16只,模型组16只,采用Hulth模型,自手术当日起肌注普鲁卡因青霉素40万u,每日一次,连续3天；治疗组每日向治疗组兔左膝关节腔内注射40mg/LO2—O3混合气体2ml,连续注射7天；对照组每日向对照组兔左膝关节腔内注射40mg/L022ml,连续注射7天；连续注射7天后,耳缘静脉注入空气处死实验兔,将实验兔的左膝关节备皮,碘伏消毒,切开左膝关节腔,行大体观察,锐利刀片切取左股骨内髁软骨,将软骨标本置于10%甲醛中固定,经一系列脱水、10%EDTA脱钙处理,共10天；软骨组织石蜡包埋；HE染色,生物显微镜观察。结果：O3实验组软骨表面细胞变性、排列紊乱、可见软骨细胞坏死、脱落,少量的炎性渗出物,软骨表面可见糜烂斑,成纤维细胞和毛细血管增生相对少见；OA对照组软骨表面细胞排列紊乱、坏死、变性较实验组明显,可见明显的溃疡,达深层软骨,可见明显的炎性细胞渗出及成纤维细胞和新生的毛细血管增生,可见纤维组织增生于溃疡底部及溃疡底部的软骨细胞变性。结论：O3试验组关节软骨退变的程度较OA对照组减轻,软骨缺损也较轻,表明40mg/LO2-O3的混合气体能有效延缓兔膝关节骨关节炎的软骨退变的病理进程。目的：观察O3对Hulth模型OA软骨电镜下改变的影响。方法：32只兔随机分为2组,分别为治疗组16只,模型组16只,采用Hu1th模型,自手术当日起肌注普鲁卡因青霉素40万u,每日一次,连续3天；治疗组每日向治疗组兔左膝关节腔内注射40mg/LO2—O3混合气体2ml,连续注射7天；对照组每日向对照组兔左膝关节腔内注射40mg/LO2 2ml,连续注射7天；连续注射7天后,耳缘静脉注入空气处死实验兔,将实验兔的左膝关节备皮,碘伏消毒,切开左膝关节腔,行大体观察,锐利刀片切取左侧股骨内髁关节软骨修剪成1×1×2mm的小条；3%戊二醛酸固定24小时；0.1M磷酸缓冲液冲洗3次；0.1%四氧化锇固定90min；去离子水冲洗3次；不同浓度丙酮逐级脱水；脱钙液脱钙后以61G环氧树脂浸透、包埋、硬化后修块,半薄切片；定位后切0.05mm超薄切片,电子染色后电镜观察。结果：OA对照组大部分的软骨细胞明显肿胀且形态不规则,细胞周晕消失,粗面内质网明显扩张,微绒毛断裂且变短,粗面内质网网膜溶解断裂,胞浆内可见脂滴存在,细胞核形态不规则,细胞核严重变形、凹陷,出现腔隙陷窝及囊泡形成等改变；O3实验组软骨细胞大部分均正常,细胞为椭圆形或梭形,细胞核完整,可见细胞核内异染质轻度边集,线粒体散在分布于胞浆内,粗面内质网较对照组丰富,表面可见许多微小突起。结论：O3试验组的关节软骨细胞退变的程度较OA对照组减轻,软骨缺损也较轻,表明O3能有效延缓关节软骨退变的病理进程。二、O3对软骨细胞中IL1β表达的影响目的：观察O3对Hu1th模型OA软骨细胞中IL1β表达的影响。方法：将36只兔随机分为3组,分别为治疗组16只,模型组16只,正常组4只,采用Hu1th模型,自手术当日起肌注普鲁卡因青霉素40万u,每日一次,连续3天；治疗组每日向治疗组兔左膝关节腔内注射40mg/LO2—O3混合气体2ml,连续注射7天；对照组每日向对照组兔左膝关节腔内注射40mg/L022ml,连续注射7天；连续注射7天后,耳缘静脉注入空气处死实验兔,将实验兔的左膝关节备皮,碘伏消毒,切开左膝关节腔,耳缘静脉注入空气栓塞处死实验兔,造模的左膝关节备皮,消毒,切开膝关节,刀片切取左侧股骨内髁软骨修剪成1×1×2mm小条,3%戊二醛酸溶液固定24小时；DAB法检测软骨细胞IL1β；每张切片在软骨破坏的边缘随机选取视野,每个视野计数200个细胞,统计阳性染色细胞的个数,以阳性细胞率作为IL-1β的表达指标。结果：正常组（A组）阳性细胞率为2.815±0.827%,模型组（B组）阳性细胞率为47.159±4.431%①,O3治疗组（C组）阳性细胞率为27.771±4.085%②；模型组（B组）与正常对照组（A组）比较,p<0.01；治疗组（C组）与模型组（B组）比较,p<0.05,有统计学意义。结论：实验组软骨细胞中IL-1β含量低于对照组,提示O3能够降低软骨细胞中IL-1β含量,保护关节软骨。三、O3对关节液中一氧化氮含量的影响目的：观察O3对Hulth模型OA关节液中一氧化氮（nrticioxide, NO）的含量的影响。方法：32只兔随机分为2组,分别为治疗组16只,模型组16只,采用Hulth模型,自手术当日起肌注普鲁卡因青霉素40万u,每日一次,连续3天；治疗组每日向治疗组兔左膝关节腔内注射40mmg/LO2—O3混合气体2ml,连续注射7天；对照组每日向对照组兔左膝关节腔内注射40mg/L±2 2ml,连续注射7天；连续注射7天后,将实验兔以速眠新Ⅱ号注射液（0.2ml/kg）肌肉内注射麻醉,麻醉效果满意后,将造模的左膝关节备皮,碘伏消毒,膝关节穿刺,刺入关节腔后,用1ml生理盐水冲洗关节腔,反复注入、回抽3次后,抽尽液体,注入试管,-70℃封存备测；硝酸还原酶法测定关节液中NO的含量。结果：对照组NO的含量为145.57±12.17,实验组为132.33+11.14,经统计学分析,实验组与对照组比较p<0：05,有统计学意义。结论：实验组关节液中NO含量低于对照组,提示O3能够降低关节液中NO含量,保护关节软骨。四、O3对软骨细胞iNOS表达的影响目的：观察±3对Hulth模型OA软骨细胞中iNOS表达的影响。方法：32只兔随机分为2组,分别为治疗组16只,模型组16只,采用Hulth模型,自手术当日起肌注普鲁卡因青霉素40万u,每日一次,连续3天；治疗组每日向治疗组兔左膝关节腔内注射40mg/LO2—O3混合气体2m1,连续注射7天；对照组每日向对照组兔左膝关节腔内注射40mg/ L02 2ml,连续注射7天；连续注射7天后,耳缘静脉注入空气,栓塞处死实验兔,造模的左膝关节备皮,消毒,立即切开左侧膝关节,刀片切取股骨内髁关节软骨修剪成1×1×2mm小条,半定量RT-PCR的方法检测软骨中一氧化氮合酶的含量。结果：实验组iNOS mRNA的含量为0.74±0.17,对照组iNOS mRNA的含量为0.83±0.21,统计学分析显示：两组间差异有统计学意义（F=12.1.91,P<0.01）,进一步的统计学分析显示,03实验组软骨iNOS mRNA的表达水平显著低于对照组。结论：对照组OA软骨中iNOS高表达,实验组OA软骨中iNOS低表达,实验组软骨iNOS mRNA的表达水平显著低于对照组,O3可以明显地抑制软骨iNOS的表达。五、O3对软骨细胞MMP-1表达的影响目的：观察O3对Hulth模型OA软骨细胞中基质金属蛋白酶-1（MMP-1）表达的影响。方法：32只兔随机分为2组,分别为治疗组16只,模型组16只,采用Hulth模型,自手术当日起肌注普鲁卡因青霉素40万u,每日一次,连续3天；治疗组每日向治疗组兔左膝关节腔内注射40mg/LO2—O3混合气体2ml,连续注射7天；对照组每日向对照组兔左膝关节腔内注射40mg/LO2 2ml,连续注射7天；连续注射7天后,耳缘静脉注入空气,栓塞处死实验兔,造模的左膝关节备皮,消毒,立即切开左侧膝关节,刀片切取股骨内髁关节软骨修剪成1×1×2mm小条,半定量RT-PCR的方法检测软骨中MMP-1的含量。结果：实验组MMP-1的含量为0.67±0.13,对照组MMP-1的含量为0.73±0.12,经统计学分析,p<0.05,差异有显著性。结论：对照组OA软骨中MMP-1高表达,实验组OA软骨中MMP-1低表达,实验组软骨MMP-1的表达水平显著低于对照组,O3能明显降低OA软骨中的MMP-1的表达,保护关节软骨。