洛伐他汀(Lovastatin)是降脂药物,此外还具有改善内皮细胞功能、抗炎症、治疗癌症等作用。洛伐他汀是一种天然他汀,普洱茶发酵过程中产生。有研究表明肿瘤周围浸润的中性粒细胞,不但降低肿瘤治疗效果,还会引发肿瘤的转移。虽然有文献报道洛伐他汀不但具有抗炎功能,还能抗肿瘤,但其机理不明。因此,本实验从洛伐他汀的抗炎作用角度入手,探究洛伐他汀对中性粒细胞的影响是否能够帮助肿瘤的治疗,为洛伐他汀在肿瘤治疗方面的应用提供理论依据。本实验以洛伐他汀、转基因斑马鱼(mpx:e GFP)斑马鱼、Bal B/c小鼠为主要实验材料,进行了以下内容的研究:1. 洛伐他汀对斑马鱼炎症模型中性粒细胞数量的影响用无菌一次性手术刀片将3dpf(days post fertilization)的转基因斑马鱼(mpx:e GFP)幼鱼长0.4mm的尾尖处切断建立炎症模型,分成对照组、30n M洛伐他汀组和60n M洛伐他汀组,每组20条,选择培养4h和22h两个时间点观察洛伐他汀对中性粒细胞在炎症部位聚集数量的影响。结果显示:4hpi(hours post injury)时洛伐他汀没有明显减少斑马鱼全身的中性粒细胞数量,但是减少了尾部炎症部位的中性粒细胞数量且具有极显著差异;22hpi时斑马鱼全身和尾部的中性粒细胞数量均显著减少。这表明洛伐他汀具有抑制中性粒细胞在斑马鱼炎症部位募集的作用。总体而言,洛伐他汀对中性粒细胞在炎症部位的募集有抑制作用,明显减少了中性粒细胞的数量。我们推测中性粒细胞数量的减少可能是洛伐他汀影响了中性粒细胞的凋亡或者迁移所导致的。3. 洛伐他汀对斑马鱼炎症部位中性粒细胞凋亡的影响首先检测洛伐他汀对细胞增殖和凋亡相关蛋白ERK1/2和AKT1/2/3磷酸化的影响,并用相应蛋白抑制剂处理斑马鱼胚胎以确认这些蛋白在中性粒细胞数量减少过程中的作用。结果显示:洛伐他汀显著抑制了促增殖抗凋亡蛋白p-ERK和p-Akt表达,并且当其被抑制时炎症部位中性粒细胞的数量也减少了,因此可以推测洛伐他汀促进了细胞凋亡的水平。然后使用斑马鱼胚胎免疫染色与TUNEL原位末端凋亡标记法进一步确认用洛伐他汀对斑马鱼炎症部位中性粒细胞凋亡的影响。我们用洛伐他汀(30n M)将斑马鱼分别处理了2h、9h和12h。从结果中可以看出,2h时洛伐他汀处理略微增加了中性粒细胞的凋亡数量,但并没有差异;9h和12h时洛伐他汀明显提高了中性粒细胞的凋亡水平。因此我们可以得出洛伐他汀显著提高了斑马鱼炎症部位的细胞凋亡水平的结果。4. 洛伐他汀对中性粒细胞迁移的影响用q RT-PCR检测洛伐他汀处理后中性粒细胞正向迁移和反向迁移相关基因在不同时间表达的变化。结果表明,洛伐他汀处理后,促进正向和反向迁移的相关基因的表达都被抑制了,即洛伐他汀处理后中性粒细胞的迁移整体被抑制,这与炎症部位中性粒细胞数量减少的实验结果是相违背的。因此,我们可以推测洛伐他汀所导致的中性粒细胞数量在炎症部位的减少与中性粒细胞的迁移无关。5. 洛伐他汀结合细菌治疗抑制结肠癌小鼠模型肿瘤的研究已知细菌治疗抑制肿瘤方面有较好的效果,但存在容易复发等不足。我们推测与肿瘤周围聚集大量中性粒细胞有关。因此我们将洛伐他汀与细菌治疗相结合来治疗小鼠结肠癌肿瘤。将5-6周龄雄性Bal B/c小鼠接种CT26肿瘤后,随机分成PBS、S.t?pp Gpp、洛伐他汀和S.t?pp Gpp+洛伐他汀组。当肿瘤体积长到120-160 mm~3时,经尾静脉注射3×10~7CFU细菌以及腹腔注射洛伐他汀(30mg/kg)。之后每2天对肿瘤体积进行一次测量,直至肿瘤体积长到≥1500mm~3。结果显示,与PBS组比较单独洛伐他汀处理组明显抑制了肿瘤的生长,这说明洛伐他汀本身具有一定的抑制肿瘤的效果;S.t?pp Gpp组细菌注射后10天内,肿瘤体积逐渐减小甚至脱落,但10天之后却又逐渐复发,但细菌治疗与洛伐他汀联合使用后,大幅度得减缓了肿瘤复发速度,甚至使肿瘤完全脱落:肿瘤完全脱离2只,减缓复发速度20只。这表明,洛伐他汀本身就具有一定的抗肿瘤效果,并且对细菌治疗抑制肿瘤起到了积极的促进作用。我们设计了S.tΔpp Gpp和S.tΔpp Gpp+洛伐他汀联合处理的两组,并在处理后的第2天和第6天收集小鼠的肿瘤、肝、肺、脾进行细菌培养和计数,以此来研究洛伐他汀对S.tΔpp Gpp工程菌靶向肿瘤能力以及在肿瘤中存留时间的影响。结果显示,处理6天之后洛伐他汀与细菌联合治疗组的肿瘤中的细菌数显著高于单纯细菌治疗组;并且无论是处理后的第2天还是第6天,两组肿瘤中聚集的细菌数均远远高于其他组织。由此可以看出,洛伐他汀能有效地延长S.tΔpp Gpp工程菌在肿瘤内的存在时间。综上所述,洛伐他汀通过促进中性粒细胞的凋亡减少了中性粒细胞的数量,并且不管是单独使用还是与细菌治疗联合都有明显的抑制肿瘤的作用。