【摘 要】
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目的:(1)通过对BCG感染巨噬细胞后miR-548o-3p在不同时间段的表达量进行动态研究及分析,为研究结核分枝杆菌对人体的感染机制提供数据参考。(2)对结核患者血液中miR-548o-3p的表达量进行检测,为结核病患者的临床诊断提供参考。方法:(1)用BCG菌株对THP-1诱导后的巨噬细胞系进行感染,以空白组作为对照,用超速离心的方法获取被BCG感染72h的细胞上清中的外泌体,运用透射电子显微
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目的:(1)通过对BCG感染巨噬细胞后miR-548o-3p在不同时间段的表达量进行动态研究及分析,为研究结核分枝杆菌对人体的感染机制提供数据参考。(2)对结核患者血液中miR-548o-3p的表达量进行检测,为结核病患者的临床诊断提供参考。方法:(1)用BCG菌株对THP-1诱导后的巨噬细胞系进行感染,以空白组作为对照,用超速离心的方法获取被BCG感染72h的细胞上清中的外泌体,运用透射电子显微镜鉴定外泌体。(2)将提取到的外泌体再进行总RNA提取,再将总RNA运用Illumina高通量测序,运用生物信息学方法对测序结果进行差异表达分析。(3)将筛选出的miRNA进行细胞验证,并对其在BCG感染后12h、36h和72h的表达量进行动态研究。(4)抽取健康人和肺结核患者的血清,用试剂盒的方法提取外泌体中的总RNA,再用q-PCR的方法检验miR-548o-3p在结核患者和健康人之间表达的差异性。结果:(1)THP-1细胞在PMA诱导后出现伪足,呈巨噬细胞形态,诱导成功;透射电子显微镜结果显示沉淀直径在40-100nm范围内,表明沉淀为外泌体。(2)相对于空白对照组,BCG感染组显示上调的miRNAs有42个,显示下调的miRNAs有13个(|log2FC|≥1)并对表达差异的miRNA进行热图分析,根据FC值,Reads值以及文献查阅等综合分析,最终选择miR-548o-3p为研究对象。(3)在外泌体当中,感染组中miR-548o-3p的表达量相对于未感染组在12h和36h有明显上升趋势,且在72h时,出现了下调趋势。而在细胞内miR-548o-3p的表达量一直是上升趋势,并且在36h-72h之间上升更加明显。(4)在临床患者血液当中检测到的miR-548o-3p的量相对于健康人具有明显上升趋势。结论:(1)建立了BCG菌株感染THP-1细胞系的外泌体分离和鉴定技术。(2)通过RNA文库成功构建,生物信息学对数据的分析,找到了BCG感染组与对照组存在差异表达miRNA,并进行了miR-548o-3p的动态研究分析。结果分析表明外泌体当中的miR-548o-3p可能在36h-72h之间细胞向外分泌的量减少,导致外泌体中的miR-548o-3p的量明显降低,且细胞当中miR-548o-3p的量出现积累而导致明显上升(3)临床结果分析显示显示外泌体中miR-548o-3p在活动性肺结核的临床诊断中可能具有一定的潜在价值。
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