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苹果是我国产量最大的果树之一。影响植物生长与分布的最主要因素是低温、盐胁迫等逆境,由于冻害与盐碱地所引发的损失情况愈加异常严峻。培育优质的抗寒耐盐新品种便成为了当务之急。本研究以抗寒苹果砧木山定子(Malus baccata(L.)Borkh)为试材,以从中克隆得到两个新的乙烯应答因子(ERF)为研究对象,提取山定子的RNA,将其反转录成单链cDNA,PCR扩增得到山定子ERF基因,利用DNAMAN 5.2软件对这两条基因进行比对发现其氨基酸序列的同源性高达99.38%,将这其分别命名为MbERF11和MbERF12,其开放阅读框均为483 bp,推测MbERF11和MbERF12基因负责编码由160个氨基酸组成的蛋白质,预测MbERF11蛋白质的理论分子质量MW=17.967 kDa,理论等电点pI=9.27。预测MbERF12蛋白质理论分子质量MW=17.918 kDa,理论等电点pI=9.3。对MbERF11和MbERF12蛋白进行亚细胞定位,显示MbERF11和MbERF12蛋白均定位在细胞核中。利用MEGA 7软件构建MbERF11和MbERF12基因与其它物种里同源基因的系统进化树,显示MbERF11和MbERF12都与苹果(Malus domestica)MdERF011-like的同源性最高。半定量PCR结果显示,在正常Hoagland营养液培养时(0 h),MbERF11和MbERF12在所有的检测部位都表达,且在新根和茎里的表达丰度高。在低温处理时,MbERF11和MbERF12基因的表达量在胁迫的第3 h开始到第24 h,新叶中的表达持续增强,在新根中从第3 h开始增强直到第12 h达到峰值,第24 h时均降低;高盐处理过程中MbERF11和MbERF12基因在新叶与新根中的表达量都是先升高再降低,分别在12 h和6 h时达到最高。实时荧光定量PCR分析显示当正常Hoagland营养液培养时(0 h),MbERF11和MbERF12基因在不同部位的表达情况为:新根表达量最高,次之是茎、新叶与成熟叶。在盐胁迫(200mM NaCl)、低温(4~°C)和乙烯利(500μL/L)处理时,山定子新叶中的MbERF11和MbERF12基因表达量随着处理时间的增加,呈现先增后减的趋势,分别在高盐处理12 h、低温24 h和乙烯利处理4 h时达到最大。在山定子新根中,在高盐、低温和乙烯利处理时,随着处理时间的延长,MbERF11和MbERF12基因表达量同样显示先增后减的趋势。分别在高盐处理8 h、低温12 h和乙烯利处理2 h时达到最大。与半定量PCR结果一致。在本研究中,运用农杆菌介导法将山定子MbERF11和MbERF12基因在拟南芥中过表达,分别得到了3个转基因株系,经NaCI处理7天后,盐胁迫处理后的野生型比转基因拟南芥表现出明显的黄化现象;经抗寒性鉴定,转MbERF11和MbERF12基因拟南芥的抗冻能力均极显著高于野生型。我们检测的与植物抗性相关的生理指标显示,转MbERF11和MbERF12基因的拟南芥各株系中脯氨酸含量及SOD、POD和CAT活性均较未处理组升高,MDA含量较对照组变化不大,叶绿素含量降低,且和对照组有极显著差异。说明在低温和盐处理后转MbERF11和MbERF12基因拟南芥植株受损伤程度较小,对低温和盐胁迫的抗性增强。综上所述,过表达MbERF11和MbERF12基因都可以增强转基因拟南芥对低温及盐胁迫的耐受性。