胃癌(Gastric cancer,GC)是一种高发病率、高死亡率的恶性肿瘤,治疗的整体疗效不佳,5年生存率仍较低。胃癌已发现一系列危险因素,如饮食因素、Epstein-Barr病毒、幽门螺杆菌感染等,遗传因素及其对细胞过程下游效应在胃癌进展中发挥了重要作用,但胃癌的发病机制仍然复杂。尽管在癌症的诊断和治疗方面取得了一定的进展,但胃癌患者的预后仍不理想,5年生存率低于30%。因此,寻找新的生物标志物和有效的治疗靶点成为胃癌患者迫切需要解决的问题。随着生物信息学领域和基因组测序技术的发展,人们对肿瘤发病机制、诊断、治疗和预防的进一步探索带来了希望。肿瘤坏死因子样配体1A(TNF-like ligand 1A,TL1A),又称TNFSF15,是由内皮细胞、活化的T细胞、巨噬细胞、单核细胞和树突状细胞产生,其作用是抑制内皮细胞的增殖和血管生成,被报道参与调节血管内稳态和炎症。既往研究报道TL1A在风湿性关节炎(RA)、哮喘、炎症性肠病等多种自身免疫性炎症疾病中发挥重要作用。此外,TL1A已被证实参与多种肿瘤的发展,因此被认为是癌症治疗的潜在治疗靶点。近有报道称TL1A表达降低与乳腺癌患者预后不良有关。然而,TL1A在胃癌中的表达情况及其在肿瘤发生发展中的作用仍不清楚,难以明确且鲜有报道。目的:在本研究中,我们旨在通过利用肿瘤相关数据库和生物信息学方法,以及免疫组织化学、Western Blot、qPCR等分子生物学实验技术方法,对胃癌组织中TL1A的表达量,与临床病理因素之间的关系及预后进行分析,明确TL1A在胃癌发展中的作用。并且,通过体外实验探讨TL1A对胃癌细胞生物学行为的影响,旨在阐明TL1A在胃癌中发挥作用的可能机制,为诊断和治疗胃癌提供新的靶点。研究方法:1、通过应用肿瘤基因组图谱(TCGA)、GEPIA和UALCAN在线数据库检索胃癌组织样本和癌旁正常组织样本RNA-seq基因表达数据,比较TL1A在胃癌组织与癌旁正常组织mRNA水平表达上的差异,分析其与临床病理因素之间的关系,并登录Kaplan-Meier网站(http://kmplot.com)分析评价TL1A基因在胃癌中预后价值。2、收集104例近三年承德医学院附属医院行手术治疗切除胃腺癌患者的癌组织及34例癌旁正常组织(距癌组织5 cm)石蜡包埋标本,采用免疫组织化学染色方法检测TL1A的表达,分析其与临床病理因素之间的关系。另外收集2017年手术切除的20例新鲜胃癌组织标本,采用实时荧光定量PCR(qPCR)及Western Blot检测mRNA和蛋白水平的表达。3、我们应用免疫荧光共聚焦应用免疫荧光染色及激光扫描共聚焦荧光显微镜,观察胃癌细胞系AGS、MGC803、BGC823、SGC7901、HGC27及胃正常上皮细胞株GES-1内TL1A表达及定位。4、在了解了TL1A在胃癌组织中的表达及其与临床病理相关性后,为了进一步印证TL1A的表达情况,也为下一步体外进行生物学行为作用和分子生物学功能的探讨,我们采用qPCR技术及Western Blot技术进一步检测胃癌细胞系AGS、MGC803、BGC823、SGC7901、HGC27及胃正常上皮细胞系GES-1内TL1A表达情况。以上均为明确TL1A在胃癌中的表达情况及与胃癌发生发展的关系。5、为了进一步明确TL1A对胃癌细胞的生物学功能,我们选用胃癌细胞系Western Blot检测结果中显著高表达的两株细胞系AGS和MGC803分别双向转染TL1A shRNA(3条)和过表达TL1A质粒。通过荧光显微镜,qPCR和Western Blot对转染效率进行观察和验证。选出sh1-TL1A,sh3-TL1A两条shRNA和过表达TL1A质粒进行细胞功能学检测。6、为了进一步确定,我们选择敲减效率最好的一条TL1A-shRNA包装成慢病毒,建立TL1A稳转敲减AGS细胞系,进行细胞功能学的的再次观察。7、为了深入的研究TL1A在胃癌中的作用机制,我们通过两条shRNA敲减质粒和TL1A过表达质粒双向转染AGS和MGC803,Western Blot实验技术检测在肿瘤生物学功能中发挥重要作用的相关蛋白。8、有变化趋势的蛋白与PI3K/Akt信号通路密切相关,我们用Western Blot检测PI3K/Akt通路相关蛋白,并应用PI3K/Akt信号通路的蛋白激酶抑制剂LY294002进行干预,应用CCK8、平板克隆形成、Transwell实验方法来检测对胃癌细胞增殖和迁移的作用,Western Blot检测相关蛋白变化,旨在明确TL1A在胃癌中的作用机制。结果:1、基于TCGA数据库检索收集375例胃癌肿瘤患者样本和50例正常胃组织样本RNA-seq基因表达数据及临床资料,多维标度(multidimensional scaling,MDS)分析显示,与癌旁正常组织相比,胃癌肿瘤标本集中在图像中部。TL1A在胃癌组织样本中的表达高于癌旁正常组织(Log FC=1.07),差异有统计学意义(P<0.05,P=8.90E-07)。基于GEPIA在线数据库中检索到408例胃癌组织样本和211例正常组织样本,分析得到,与癌旁正常组织相比,胃癌组织样本中的TL1AmRNA明显高表达,差异具有统计学意义(P<0.01),此外,TL1A的表达与胃癌临床分期的关系无统计学意义。应用UALCAN在线数据库对检索到的胃癌组织样本和正常胃组织样本分与胃癌临床病理因素进行分析,结果分析显示TL1A的表达与胃癌分化程度及幽门螺旋杆菌感染状态有关,差异具有统计学意义(P<0.01,P<0.01)。接着为评价TL1A基因在胃癌中预后价值,利用JetSet best probe set(仅含HGU133+2.0微阵列数据)进行KM plot(http://kmplot.com)分析,根据基因表达的中位数,将数据库中876例胃癌患者分为TL1A的高表达组和低表达组。结果表明,TL1A高水平的患者整体生存率(OS)明显低于低水平的患者,呈明显负相关(P<0.01,P=2.6E-07)。这些生物信息学分析结果充分说明,TL1A在胃癌中的表达有重要意义。2、通过免疫组织化学染色实验检测,在收集的104例胃癌组织中,TL1A在细胞膜、细胞浆、细胞核均有表达。其中,TL1A高表达76例,低表达28例。34例癌旁正常组织主要以细胞膜和细胞浆表达为主,其中TL1A低表达32例,高表达2例。与癌旁正常组织相比,TL1A在胃癌中表达明显升高(P<0.05)。此外,在染色结果中注意到随着胃癌分化越低,TL1A的表达越高。Western Blot及qPCR结果也显示胃癌组织中的TL1A表达显著高于配对癌旁正常组织(P<0.01,P<0.01),表明TL1A升高可能与胃癌的发生有关。进而,我们又分析了TL1A表达与胃癌临床各病理因素的相关性,分析结果证实TL1A表达与胃癌分化程度、肿瘤大小存在相关关系,其它没有统计学意义,与生物信息学分析结果一致,提示TL1A与胃癌的发展有关。3、应用免疫荧光染色及激光扫描共聚焦荧光显微镜观察结果显示,TL1A蛋白在GES-1中主要定位于细胞膜和细胞浆,在其他胃癌细胞系AGS、MGC803、BGC823、SGC7901、HGC27中定位以细胞浆为主,细胞膜和细胞核也有表达,此外,胃癌细胞系中的TL1A呈高表达。所得结果与免疫组织化学染色结果一致。4、采用Western Blot技术及qPCR技术进一步检测胃癌细胞系AGS、MGC803、BGC823、SGC7901、HGC27及胃正常上皮细胞系GES-1内TL1A表达情况。结果显示:与GES-1相比,AGS、MGC803细胞TL1A基因和蛋白显著高表达。我们还检测了各胃癌细胞系分离提取胞浆蛋白及核蛋白中TL1A的表达情况,结果显示与总蛋白趋势一致,更加进一步证实TL1A在胃癌中表达于胞浆和胞核。5、下调AGS细胞中TL1A时,3条TL1A-shRNA(sh1-TL1A,sh2-TL1A,sh3-TL1A)组与阴性对照shRNA(sh-NC)组相比,mRNA水平敲减效率分别为:0.1626±0.04,2.729±0.41,0.3037±0.04,具有统计学差异(P<0.01)。蛋白水平验证结果与其一致。下调MGC803细胞中TL1A时,3条TL1A-shRNA(sh1-TL1A,sh2-TL1A,sh3-TL1A)组与阴性对照shRNA(sh-NC)组相比,mRNA水平敲减效率分别为:0.0767±0.06,3.156±0.58,0.3136±0.013,具有统计学差异(P<0.01)。蛋白水平验证结果与其一致。因此,我们在后续的实验中选用sh1-TL1A,sh3-TL1A两条shRNA进行功能学实验检测。上调AGS、MGC803细胞TL1A时,TL1A过表达质粒pHBLV-TL1A(OE-TL1A)组与pHBLV空载体(OE-NC)组相比,mRNA水平转染效率分别为623.7±23.74,29.82±10.3,具有统计学差异(P<0.01,P<0.01)。蛋白水平验证结果与其一致。通过CCK8和平板克隆形成和Transwell实验检测分析得出TL1A可以促进胃癌细胞的增殖和迁移能力。6、选择敲减效率最好的一条TL1A-shRNA包装成慢病毒,建立TL1A稳转敲减AGS细胞系,mRNA水平敲减效率为0.3756±0.077,蛋白水平验证结果一致。利用AGS TL1A敲减稳转细胞系,共转染TL1A过表达质粒,分为四组:LV-NC-NC、LV-NC-TL1A、LV-TL1A-RNAi-NC、LV-TL1A-RNAi-TL1A进行TL1A表达回复,进一步验证TL1A在胃癌细胞系中生物学功能,得到了一致的结果。因此,我们确定,TL1A在胃癌中过表达,促进胃癌的增殖和迁移,深入研究TL1A有很大意义。7、为了深入的研究TL1A在胃癌中的作用机制,我们通过两条shRNA敲减质粒和TL1A过表达质粒双向转染AGS和MGC803,Western Blot实验检测结果发现与阴性对照组shRNA(sh-NC)相比,转染TL1A-shRNA(sh1-TL1A,sh3-TL1A)的胃癌细胞AGS和MGC803的PCNA、CDK2、ROCK1、RhoA表达降低,p21、p27表达升高;与只转载空载体(OE-NC)组相比,OE-TL1A组的PCNA、CDK2、ROCK1、RhoA表达升高,p21、p27表达降低。这些差异蛋白分析后,发现与PI3K/Akt这条信号通路密切相关。8、我们应用Western Blot检测了PI3K/Akt信号通路中的PI3K 110β和85α以及p-Akt,结果发现,与阴性对照组shRNA(sh-NC)相比,转染TL1A-shRNA(sh1-TL1A,sh3-TL1A)的胃癌细胞AGS和MGC803在TL1A被敲减后,PI3K110β、PI3K85α、p-Akt表达也随之降低;与只转载空载体(OE-NC)组相比,OE-TL1A组的PI3K110β、PI3K85α、p-Akt表达也随之升高。结果说明,TL1A促进胃癌的增殖和迁移与PI3K/Akt信号通路有关系。为了进一步证实,我们应用了PI3K/Akt细胞信号传导通路的蛋白激酶抑制剂LY294002。结果证实,在DMSO对照组中,过表达TL1A促进胃癌细胞AGS和MGC803的增殖,使用PI3K/Akt信号通路的蛋白激酶抑制剂LY294002后,细胞生长及迁移能力被抑制,Western Blot检测结果显示:在DMSO对照组中,过表达TL1A后,PI3K110β、PI3K85α、p-Akt、PCNA、CDK2、ROCK1、RhoA表达也随之升高,p21、p27表达降低,使用PI3K/Akt信号通路的蛋白激酶抑制剂LY294002后,这些表达变化被抑制。以上实验结果证实TL1A可以通过PI3K/Akt信号通路促进胃癌细胞的增殖和迁移能力。结论:1、TL1A在胃癌中主要定位于细胞浆、细胞核并且高表达。2、TL1A高表达与胃癌患者的分化程度、肿瘤大小正相关,与胃癌患者生存率呈明显负相关。3、TL1A促进胃癌的增殖和迁移。4、TL1A通过PI3K/Akt信号通路促进胃癌的增殖和迁移。