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普鲁兰酶(pullulanase)通过水解α-1,6糖苷键从而将支链淀粉的分支结构切除获得直链淀粉,大大提高淀粉的利用率,在食品工业中的应用前景广阔。本研究从当前新兴的高通量筛选技术角度出发,对深孔板(Microtiter Plate,MTP)的基础参数进行了研究并建立了基于MTP的高通量培养技术以及高通量筛选技术。利用该高通量筛选技术对鲁兰酶文库快速高效筛选并获得了一株突变菌株。本研究的主要结论如下:1、从耐高温、隔绝杂菌、透气性、防止水分挥发等方面研究了PP、PTFE以及e PTFE三种材质透气膜的性能,综合考虑,PTFE以及e PTFE材质的防水透气膜更加适用于“三明治”盖子。对MTP的氧传递系数kLa、微生物培养的可行性、平行性进行了研究,发现24孔MTP与48孔MTP传氧性能好,可达到摇瓶规模,大肠杆菌在MTP中的生长状态要优于摇瓶。研究者需根据微生物对氧气的需求以及实验要求选择合适的MTP及培养体积。96孔板由于氧传递性能差,不适宜进行好氧微生物的培养。2、在大肠杆菌中实现了普鲁兰酶基因(Gen Bank Accession No:AX203843)的异源表达,并在摇瓶规模对发酵条件进行了初步探索。优化得到的培养条件为:采用TB/SB培养基作为发酵培养基,接种终OD595为0.025,37?C 230 r·min-1条件下进行发酵,发酵5.5 h后将温度降低至20?C并开始诱导,诱导剂IPTG终浓度0.1 mmol·L-1同时添加终浓度为0.16 mol·L-1甘氨酸和0.1 mol·L-1氯化钠。诱导20 h后上清中酶活为5.1 U·m L-1。3、将基于摇瓶的发酵参数成功的Scale-down至MTP水平,建立了基于MTP的高通量培养技术。将常规的普鲁兰酶酶活测定方法移植于96孔MTP中,建立了普鲁兰酶酶活高通量检测方法,并与通量培养技术偶联建立了普鲁兰酶高通量筛选方法。4、利用易错PCR技术对普鲁兰酶基因进行扩增,扩增产物重组于表达载体p ET-28a(+)-pel B中,并导入E.coli BL21(DE3)感受态细胞构建文库,利用该高通量筛选方法实现了突变体文库的快速高效筛选并获得了一株突变菌株4A4,其分泌量提高了46.5%。该方法不仅适用于淀粉酶、纤维素酶等酶类的高通量筛选,同时为菌株文库的筛选以及蛋白质的定向进化提供了一种新思路。5、利用His-tag Protein Purification磁珠方法对普鲁兰酶进行纯化,并分析了纯化后的普鲁兰酶酶学性质。分析结果表明,定向进化前后的普鲁兰酶最适反应温度为60?C,最适反应p H为5.0,与野生型普鲁兰酶一致。本研究结果为普鲁兰酶的异源表达提供了理论基础,同时建立的普鲁兰酶高通量筛选方法为突变文库的快速筛选提供了指导,也为普鲁兰酶分泌提供了基础数据。