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效应因子是一类由植物病原菌合成并分泌进入宿主体内,从而达到操纵并干扰宿主以完成其侵染的一类蛋白。其中包括传统概念的无毒蛋白(Avr蛋白)、激发子(elicitor)、毒蛋白以及一些降解酶等。真菌病原效应因子主要通过内质网一高尔基体的蛋白分泌系统分泌到宿主体内,这不同于细菌的Ⅲ型分泌系统,而真核病原菌分泌蛋白的主要特征是其N-末端有一个约5-30个疏水氨基酸残基的信号肽。本实验室以ILLUMINA平台对水稻纹枯病菌全基因组测序并分析,初步组装分析发现AG1-IA编码965个分泌蛋白(占总蛋白的9.17%),将分泌蛋白与数据库同源比对后,获得了候选效应因子。本研究开展对候选效应因子的表达与初步验证,主要有以下结论:1.效应蛋白的原核表达:本实验以效应因子IA008560 CDS序列为模板设计引物,以IA反转录cDNA为PCR模板,扩增产物sanger测序验证后,构建原核表达载体pGEX-4T-1-008560,转入大肠杆菌感受态(DE3),获得了 14.8KDa的表达蛋白。2.效应蛋白引发寄主PCD与细胞分子检测:诱导效应蛋白008560原核表达,获得表达蛋白将超声波破碎后得到的粗蛋白侵染水稻叶片,48-72 h后观察发现水稻叶片产生黄化现象,以DAB染色并脱绿后发现局部有褐斑,说明叶片内部细胞过氧化氢水平提高;截取侵染孔附近叶片提取DNA,电泳结果显示水稻DNA呈梯度状降解,说明水稻叶片细胞将其染色体DNA以核小体为单位降解。同时我们将纯化后的效应蛋白侵染水稻叶片,发现发生类似的超敏反应。将纯化的效应蛋白孵育水稻原生质体,发现效应蛋白共孵育的水稻原生质体随时间推移大量死亡,5h后仅余少量细胞而对照组几乎无变化;连续取样并分别以DAPI和H2DCFDA对原生质体染色发现其细胞核不规则并逐渐分裂开来;细胞质内过氧化物水平较对照组提高。提取原生质体DNA也发现了类似的降解情况,说明该效应蛋白引起了水稻细胞的程序性死亡(PCD),这与效应蛋白侵染叶片所得结果一致。3.效应因子IA-11269的筛选与分析:基于上述方法,我们分别以候选效应因子序列为模板设计引物并构建原核表达载体pEASY-E1-11269,获得了 14.2KDa的效应蛋白。将诱导表达的粗蛋白以上述方法侵染水稻叶片,观察叶片组织是否发生PCD现象,筛选出了新效应因子IA-11269,构建融合荧光蛋白载体并转入水稻原生质体发现其定位于细胞膜。数据库比对后发现 IA-11269 具有 lfi-6-16 domain,该 domain 属于 prothymosin superfamily。而 prothymosin superfamily 常与昆虫变态有关。在 SMART 对该domain的描述是干扰素诱导蛋白6/27(IFI6/IFI27),IFI27促进细胞死亡,同时通过控制线粒体中细胞色素C的释放和调节BAX和胱门蛋白酶活性来调节IFN引起的细胞凋亡。4.对不同寄主的寄主专化性(HST)的检测:效应因子在诱导宿主超敏反应时,呈现寄主专化性(HST)。本实验用效应因子IA-11269原核表达的粗蛋白侵染不同水稻品种并观察其超敏反应,发现不同水稻品种对该效应因子的敏感性不同。5.不同分离株效应蛋白编码基因的克隆分析:我们从国内十个省市收集的十个不同毒力的纹枯病菌株中扩增了 IA-11269效应蛋白编码基因,与标准菌株比对后发现在全长基因中有了 3个SNP位点发生了突变,两个为C/T型,一个为A/G型。经翻译后比对发现,这3个SNP位点均为同义突变,不影响其氨基酸序列及功能。从浙江省富阳市采集分离的分离株FY中扩增的效应因子序列中有一段12个碱基的插入,这段插入序列对效应蛋白的功能影响还有待进一步的研究。