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猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus of swine,TGEV)能引起猪传染性胃肠炎(Transmissible gastroenteritis of swine,TGE),主要以腹泻、呕吐和严重脱水等为典型的临床症状,且容易同其他病原发生合并感染,对养猪业的健康发展构成巨大威胁。TGEV在体外感染宿主细胞不仅能引起细胞发生典型的病变效应(cytopathic effect,CPE),还能诱导细胞产生I型干扰素。对于致细胞CPE的分子机制和诱导干扰素产生的机制,前人已经做过一些探究。肿瘤抑制因子(tumor suppressor)p53从被发现以来就一直是人们研究的热点。对于其在抗肿瘤、应激、细胞周期调控、病毒感染及天然免疫方面的研究已经非常深入。已知多种病毒感染都能激活p53,且能诱导细胞凋亡,以发挥机体的先天防御作用。p53的磷酸化也可以引起干扰素激活通路的活化,进而诱导干扰素的产生。TGEV感染猪肾细胞(PK-15)后可引起p53显著上调而诱导细胞凋亡。那么p53在TGEV早期感染进程中对干扰素的产生发挥了怎样的作用?是何种调控机制?p53的活化对病毒的复制有何影响?对于这些问题的答案,目前尚未见报道。本研究以TGEV和p53野生型(WT)和敲除型(p53-/-)的猪肾细胞(PK-15细胞)为研究材料,先明确病毒感染后p53信号对β-干扰素(IFN-β)产生的影响,然后尝试解释p53在此过程中对干扰素诱导的分子调控机制。本研究将运用靶向于猪p53基因的CRISPR-Cas9慢病毒系统感染受试细胞,嘌呤霉素筛选阳性克隆细胞,利用western blotting和细胞基因组测序法鉴定,获得稳定的p53基因敲除的PK-15细胞株。然后运用实时荧光定量PCR方法检测病毒各基因以及诱导干扰素生成的信号通路中各调控因子转录水平,探索TGEV感染宿主细胞后p53对病毒复制的影响,以及p53信号通路对TGEV诱导I型干扰素生成的影响,明确p53在宿主细胞抗TGEV感染中的重要作用,进一步揭示p53信号通路影响TGEV诱生I型干扰素的分子机制。本研究主要有以下结果:1.基因测序结果显示,p53基因在454碱基位点缺失了一个碱基T,导致了p53蛋白第102位的精氨酸变成丝氨酸,并在113位时移码终止;WB蛋白印迹结果显示,构建的p53-/-PK-15细胞并未能检测出p53蛋白的表达。2.在0.1 MOI的TGEV感染下,IFN-β的mRNA水平在感染早期(6 h post infection,6 h p.i.)显著升高,24 h达到峰值,36 h后WT PK-15细胞IFN-β的mRNA水平下降;p53-/-PK-15细胞IFN-β的mRNA水平变化趋势与WT PK-15细胞基本同步,但峰值却滞后发生在36 h,且各时段IFN-βmRNA水平要低于WT PK-15细胞。细胞上清培养液IFN-β测定结果显示,IFN-β含量呈时间依赖性增加,而且p53-/-PK-15细胞中的IFN-β浓度与WT PK-15细胞相比明显受到抑制。3.诱导IFN-β产生的TLR通路中关键因子检测结果显示,TGEV感染导致WT和p53-/-PK-15细胞中TRIF,TRAM mRNA水平出现上调,且与WT细胞中的水平相比,TGEV感染的p53-/-PK-15细胞中的mRNA表达在感染后的36 h之前显著受阻。通路抑制剂resveratrol处理结果显示,resveratrol显著降低了TGEV感染的p53-/-PK-15细胞和WT PK-15细胞中IFN-βmRNA表达。RLR通路的关键因子的定量结果显示,感染的WT和p53-/-PK-15细胞中MDA5,RIG-I和IPS-1 mRNA水平也出现了显著上调,并且在感染后的36 h前,这些因子在TGEV感染的p53-/-PK-15细胞中的mRNA水平要显著低于WT细胞。通路抑制剂BX795处理结果显示,BX795抑制了p53-/-PK-15细胞和WT PK-15细胞中TGEV诱导的IFN-βmRNA表达。4.干扰素刺激基因检查结果显示,在感染后前36 h WT PK-15细胞中IRF3、IRF9、ISG15、ISG20比p53-/-PK-15细胞有更高的增加,且呈现时间依赖性。Poly(I:C)试验结果显示,poly(I:C)显著增强IFN-β和ISG15的mRNA水平,并且在TGEV和poly(I:C)共处理的PK-15细胞中ISG15的表达水平要比单独的poly(I:C)处理或TGEV感染处理显著上调,但p53-/-PK-15细胞的反应要低于WT PK-15细胞。5.对病毒的基因组RNA(gRNA)和亚基因组RNA(ORF、N)的定量结果显示,在病毒感染后的24h和36 h时p53-/-PK-15细胞中病毒gRNA、ORF、N基因的转录水平要比WT PK-15细胞显著增加。此外,poly(I:C)处理显著抑制WT PK-15细胞和p53-/-PK-15细胞中TGEV gRNA,N和ORF7的表达,并且WT PK-15细胞中的病毒基因水平比p53-/-PK-15细胞中降低更加明显。外源性IFN-β的试验也显示了同样的结果,但外源IFN-β在p53-/-PK-15细胞中抑制TGEV复制的效力要低于WT PK-15细胞。本研究初次揭示p53信号通路影响TGEV诱生I型干扰素的分子机制,阐明TGEV感染早期p53的抗病毒效应机理。为进一步研究新型抗病毒药物和治疗方法提供一定的思路和方法,为控制TGEV在养殖业中的危害提供一定的理论基础。