论文部分内容阅读
雄黄为硫化物类矿物雄黄族雄黄,是一种我国的传统矿物类中药。本论文采用高能球磨法制备纳米雄黄生品（Realgar Nanoparticles,NRP）,考察不同球磨时间对其粉体粒径及As2O3含量的影响,并以炮制品得率、残渣重量、粒径分布及As2S2与As2O3的含量为指标,考察水飞法、酸水飞法和碱水飞法对纳米雄黄生品的影响,以制备高纯度低毒性的纳米雄黄炮制品。同时采用MTT法对比研究了原药雄黄（Crude realgar,CR）、NRP及纳米雄黄炮制品（Realgar Nanoparticles Processed,NRPP）对人乳腺癌MCF-7细胞增殖的抑制作用。并采用Hoechst33258染色法、PI单染法及Annexin V-FITC/PI双标记法考察了CR和NRPP诱导MCF-7细胞凋亡的差异;同时采用Rh-123染色法检测NRPP对MCF-7细胞线粒体膜电位的影响及Western blotting（WB）蛋白质免疫印迹法检测其对p53、bcl-2、caspase8、bax、caspase9、caspase3等相关凋亡蛋白的表达的影响,以初步探讨NRPP诱导MCF-7细胞凋亡的机制。结果表明随球磨时间延长,雄黄粉体粒径呈现先减小后增大的趋势,球磨时间为16 h时,所得的雄黄粉体平均粒径最小为157.3 nm,而其所含的As2O3含量则随球磨时间延长不断增加。三种炮制方法中因酸水飞品的平均粒径最小、As2S2含量最高、As2O3含量最低,故本实验确定酸水飞法为最佳炮制方法。MTT法检测发现CR、NRP及NRPP均能抑制MCF-7细胞的增殖,并呈现一定的浓度、时间依赖性。Hoechst33258染色及Annexin V-FITC/PI双标记法可从定性及定量两个方面观察到CR及NRPP均具有体外促MCF-7细胞凋亡的作用,PI单染法检测发现CR主要将MCF-7阻滞于G2/M期,NRPP则阻滞于S期。Rh-123染色法检测发现NRPP可以降低MCF-7细胞线粒体膜电位,呈现一定的浓度、时间依赖性。WB图显示p53、caspase8、bax、cyt-c、caspase9、caspase3的表达量随NRPP作用时间的延长和药物浓度的增加上调,而bcl-2的表达量则下调,bcl-2/bax的比率下降。综合分析以上实验结果可知CR、NRP及NRPP均具有抑制MCF-7细胞增殖的作用;其中CR、NRPP的抑制作用是通过MCF-7细胞周期阻滞、诱导细胞凋亡等途径实现的;而NRPP诱导MCF-7细胞凋亡的作用机制可能与激活p53-bcl-2-caspase9通路、caspase8-线粒体-caspase9及caspase8-caspase3等通路有关。