【摘 要】
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目的:研究牛磺酸在细胞水平上对铁过载所致的肝损伤是否具有保护作用,牛磺酸的保护作用机制是否与Bcl-2/VDAC1介导的线粒体凋亡途径有关。方法:L02肝细胞作为本实验的研究对象,构建铁过载损伤模型。实验分为5个组:Control（正常对照组）、Iron（铁过载组）、Iron+Taurine（铁过载+牛磺酸组）、Iron+Taurine+NC（铁过载+牛磺酸+阴性对照组）、Iron+Taurine
【基金项目】
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国家自然科学基金（№:81760587）；
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目的:研究牛磺酸在细胞水平上对铁过载所致的肝损伤是否具有保护作用,牛磺酸的保护作用机制是否与Bcl-2/VDAC1介导的线粒体凋亡途径有关。方法:L02肝细胞作为本实验的研究对象,构建铁过载损伤模型。实验分为5个组:Control（正常对照组）、Iron（铁过载组）、Iron+Taurine（铁过载+牛磺酸组）、Iron+Taurine+NC（铁过载+牛磺酸+阴性对照组）、Iron+Taurine+si RNA Bcl-2（铁过载+牛磺酸+si RNA Bcl-2组）。1.构建铁过载损伤模型,CCK-8和流式细胞仪筛选牛磺酸最佳保护浓度,Western Blot检测Bcl-2的蛋白表达水平。2.构建Bcl-2的敲减慢病毒,并且用带GFP绿色荧光的阴性对照病毒（NC）感染细胞,在倒置荧光显微镜下观察细胞感染效率,筛选出病毒的复感染指数（MOI）及感染体系,并采用CCK-8试剂测定细胞存活率和流式细胞技术检测细胞的凋亡情况。3.Western Blot检测不同分组的Bcl-2与VDAC1蛋白表达水平,采用免疫共沉淀技术（Co-IP）检测在牛磺酸抗铁过载损伤发挥保护作用的过程中Bcl-2与VDAC1的相互作用的表达情况。4.采用流式细胞仪检测各分组的活性氧（ROS）水平,酶标仪检测各组细胞内铁离子浓度、线粒体通透性转换孔（m PTP）的开放程度、超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量,Western Blot检测各实验组细胞线粒体和胞浆内细胞色素c（Cyt c）的表达情况。结果:1.CCK-8试剂盒与流式细胞仪测定细胞存活率和细胞凋亡得出:牛磺酸的浓度为40 m M时,发挥较明显的保护作用,以此作为牛磺酸最佳保护浓度。2.筛选出慢病毒的复感染指数MOI为20,感染的最佳条件:含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基+P型感染增强液+72h感染时间,Western Blot检测MOI为20病毒感染效果较好,阴性对照病毒（NC）对Bcl-2蛋白无明显的影响。与Iron处理组相比,Iron+Taurine组与Iron+Taurine+NC组细胞存活率明显提高,细胞凋亡率降低,而转染了si RNA Bcl-2慢病毒后,细胞存活率降低,细胞凋亡显著提高,表明牛磺酸的保护作用被逆转。3.Western Blot结果显示Iron+Taurine组与Iron+Taurine+NC组Bcl-2蛋白表达含量较Control组有所增加,VDAC1蛋白表达减少。采用免疫共沉淀技术检测在牛磺酸处理下Bcl-2与VDAC1的相互作用,我们可以得出:Bcl-2与VDAC1在正常情况下（Control组）具有相互作用,经牛磺酸处理后,Bcl-2与VDAC1之间的相互作用增强,si RNA Bcl-2慢病毒感染L02细胞后,Bcl-2与VDAC1的相互作用被取消,牛磺酸的保护作用也被取消。因此结果提示牛磺酸发挥保护作用可能与其促进Bcl-2与VDAC1的相互作用有关。4.与Iron组相比,Iron+Taurine组和Iron+Taurine+NC组的SOD活性提高、MDA含量降低、线粒体通透性转换孔（m PTP）的开放程度下降,同时,牛磺酸的保护作用可因Bcl-2被敲减而被抑制。流式细胞仪测定ROS水平,Iron+Taurine组、Iron+Taurine+NC组与Iron组比细胞内活性氧（ROS）水平下降。Western Blot测定细胞线粒体与胞浆中的Cyt c含量显示:Iron组细胞色素c（Cyt c）与Control组相比在胞浆中表达明显增加,而在线粒体中表达减少,Iron+Taurine组和Iron+Taurine+NC组与Iron组相比在线粒体中表达增加,而在胞浆中表达较少,且牛磺酸的保护效应可因Bcl-2被敲减所抑制,提示牛磺酸可以通过Bcl-2保护L02细胞免受铁过载损伤,抑制Cyt c从线粒体向细胞质的转移。结论:牛磺酸主要通过调节线粒体依赖性途径来抑制肝细胞凋亡。牛磺酸可上调Bcl-2蛋白,增强Bcl-2和VDAC1之间的相互结合,减少m PTP的开放,抑制ROS爆发,并抑制Cyt c从线粒体转移到细胞质以维持线粒体膜的完整性,从而抑制肝细胞凋亡。
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