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禽流感(Avian Influenza，AI)是由A型流感病毒(InfluenzaAvirus，AIV)引起的禽类疾病综合征，该病传播迅速，传染性极强。AIV不仅能感染禽类，也能感染人，是危害人类健康和养禽业的最重要传染病之一，给人类生活和生产造成了重大损失。目前AIV根据血凝素(Hemagglutinin，HA)和神经氨酸酶(Neuraminidase，NA)可分为17个HA亚型和9个NA亚型，HA和NA具有高度变异性，同时各亚型流感病毒间也缺乏有效的交叉保护，这都制约了禽流感的有效防控及其疫苗的发展。HA是流感病毒表面主要的保护性抗原之一，能诱导机体产生中和抗体，含有多个T/B细胞表位，HA2位于HA的C端，含有高度保守的融合序列，基于HA2保守区域的通用疫苗研究一直是一个热点。基质蛋白2(matrix protein2，M2)是流感病毒表面的跨膜蛋白，由97个氨基酸组成，膜蛋白M2的氨基酸序列高度保守，尤其是N端仅由23个氨基酸残基组成的胞外区(M2extracellular domain，M2e)，尽管经历了四次世界性的流感大流行，都未发现明显差异，故有可能发展成为具有交叉保护力的“通用流感疫苗”的候选抗原。为了寻找具有广谱保护作用的通用流感疫苗，本研究根据中国H5和H9亚型流感病毒的流行情况，针对流感病毒HA2基因的保守区域设计合成多肽，同时以流感病毒高度保守的M2e基因为基础，表达重组蛋白，并通过攻毒保护试验，比较和评价HA2合成肽与M2e重组蛋白对BALB/c小鼠的免疫保护作用，为广谱型流感疫苗的深入研究提供一定的基础。具体研究内容如下：1.禽流感病毒HA2合成肽免疫保护性的初步研究通过比对GenBank中国H5和H9亚型流感病毒HA基因，针对HA2亚单位的保守区域设计合成多肽并在其末端耦联载体蛋白。用合成的多肽(LAH-KLH)、LAH-KLH+CpG、KLH、PBS与弗氏佐剂混合后分别于第0周和第3周肌肉注射BALB/c小鼠，二免两周后采集小鼠血清用ELISA检测LAH特异性IgG及IgG1/IgG2a/IgG2b，同时分离脾脏细胞和肺脏细胞用ELISPOT检测LAH特异性T/B细胞的数量，并通过攻毒保护试验、攻毒后肺脏病毒滴定及肺脏病理变化的观察来衡量HA2合成肽的免疫效果。ELISA结果显示，仅LAH-KLH+CpG免疫组检测到了与PBS对照组有极显著差异(p﹤0.01)水平的LAH特异性IgG，抗体亚型分析结果表明，LAH-KLH+CpG免疫组能诱导IgG1/IgG2a/IgG2b的分泌，但以IgG1为主。ELISPOT结果显示，在LAH肽段刺激下，LAH-KLH+CpG免疫组小鼠每1×106个脾淋巴细胞分泌IFN-γ形成的斑点数约为80个，与PBS对照组差异极显(p﹤0.01)，表明CpG促进HA2合成肽既诱导产生TH1型免疫应答，也能诱导产生TH2型免疫应答，且CpG能够有效增强HA2合成肽的免疫应答水平。攻毒试验结果显示，HA2合成肽不能对CXG11(H5N1)禽流感病毒的攻击不能提供有效的保护，仅能降低病毒在肺脏中的滴度，减轻对肺脏的病理学损伤。2.禽流感病毒M2e重组蛋白免疫保护性的初步研究通过比对GenBank中H5和H9亚型流感病毒的M2基因，分别选择H5和H9的M2基因N端由23个氨基酸组成的胞外域(M2e)序列进行合成，并将四个H5M2e和H9M2e分别与三个位于HA246-260T细胞表位交叉串联，在其末端添加酵母转录因子，然后克隆到pGEX-6p-1载体中，表达重组蛋白—SH5M2e、SH9M2e。SDS-PAGE和Western-blot分析表明，重组蛋白(SH5M2e、SH9M2e)均成功表达，而后纯化获得高纯度产物。经纯化后的重组蛋白(SH5M2e、SH9M2e)与弗氏佐剂混合后肌肉注射BALB/c小鼠，二免两周采集各组小鼠血清并用ELISA检测M2e和HA特异性IgG及IgG1/IgG2a/IgG2b，同时分离脾脏细胞，用ELISPOT检测M2e和HA特异性T细胞的数量，并通过攻毒保护试验、攻毒后肺脏病毒滴定及肺脏病理变化的观察来综合评价重组蛋白(SH5M2e、SH9M2e)的免疫保护效力。ELISA结果显示，重组蛋白(SH5M2e、SH9M2e)能诱导产生M2e特异性IgG，抗体亚型结果显示，重组蛋白(SH5M2e、SH9M2e)能诱导IgG1/IgG2a/IgG2b的分泌，但以IgG1为主。而仅SH9M2e能诱导产生HA特异性IgG与IgG1。ELISPOT结果显示，在M2e肽段刺激下，各免疫组小鼠每1×106个脾淋巴细胞分泌IFN-γ形成的斑点数约为150个，在HA肽段刺激下，各免疫组小鼠每1×106个脾淋巴细胞分泌IFN-γ形成的斑点数约为130个，表明成功表达的重组蛋白(SH5M2e、SH9M2e)均具有良好的免疫原性，既能诱导产生TH1型免疫应答，也能诱导产生TH2型免疫应答。攻毒试验结果表明，重组蛋白(SH5M2e、SH9M2e)对CXG11(H5N1)禽流感病毒的攻击有一定的保护力，且攻毒后肺脏病毒滴度及肺脏病理变化也显示重组蛋白(SH5M2e、SH9M2e)能够抑制病毒在肺脏中的复制并减轻对肺脏的病理损伤。综上所述，本实验设计的HA2合成肽对CXG11(H5N1)禽流感病毒的攻击没有产生良好的保护作用；而首次成功克隆并表达了串联了T细胞表位和tGCN4的M2e多拷贝重组蛋白—SH5M2e与SH9M2e，具有良好的免疫原性和部分保护性，可以作为广谱型流感病毒重组亚单位疫苗的候选对象。