Streptomyces amritsarensis HG-16溶解微囊藻群体、拮抗禾谷镰孢菌的特性及优化发酵条件研究

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随着水体富营养化状况的持续加剧以及全球气候变暖的叠加影响,有害蓝藻水华的爆发频率越来越高、爆发范围越来越大。有害蓝藻水华会导致水质恶化、水体缺氧,有的种类还会产生有害的藻毒素,严重威胁水生生态系统安全、水生生物的生存和人类的健康。微囊藻(Mircocystis)是在富营养化淡水湖泊中最为常见的一类优势水华蓝藻。水华爆发期间,微囊藻以丰富的胞外多聚物包裹的群体(Colony)形态存在,群体有利于它们抵御不良环境和捕食者的攻击。利用微生物原位控藻受环境因素影响较大,控藻效果不够稳定,不能根治水体污染,而且已报到的溶藻菌对微囊藻群体的杀灭效果都较差。化学控藻容易破坏原生水体环境,并对水体造成二次污染。而物理打捞除藻可直接减少水体的氮磷,是目前我国大规模爆发蓝藻水华时采用的主要控藻手段,但打捞的蓝藻含水量高,不易处理,不及时处置会严重降低周围环境质量。禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)能够造成禾本科植物大量减产,且会分泌呕吐毒素(deoxynivalenol,DON),危害人体健康,生物防治是目前对病害进行防控研究的热点。本论文以一株同时具有拮抗禾谷镰孢菌和溶藻活性的链霉菌Streptomyces amritsarensis HG-16为研究对象,研究了该菌对微囊藻群体的杀灭特性和对禾谷镰孢菌的抑菌特性,还对HG-16的培养基成分及培养条件进行了优化,并通过代谢组学分析了HG-16的活性物质,以期为利用打捞的微囊藻作为营养基质发酵HG-16生产生物肥料和生物农药提供理论基础。主要结果如下:1.HG-16对微囊藻群体的溶藻特性研究。HG-16的菌液与无菌上清液对不同初始藻浓度的自然微囊藻群体均表现出较高的溶藻活性。可见光和荧光显微镜观察结果表明,水样中的藻细胞群体经HG-16处理后,藻细胞死亡变色,叶绿素被分解,但仍保持着群体的形态。该结果表明HG-16分泌的溶藻物质具有很强的杀灭微囊藻群体活性,且可以直接穿透微囊藻群体杀藻。用浮游植物荧光仪测定了HG-16对群体形态的微囊藻细胞的最大光化学量子产量Fv/Fm的影响,结果表明HG-16能在很短的时间内就对藻细胞的光合系统造成影响,显著抑制了藻细胞的光合作用。微生物多样性分析HG-16处理过的微囊藻水华水样结果表明,HG-16处理显著影响了水样的菌群结构,可能因为HG-16分泌的物质具有广谱杀菌效果。利用三维荧光谱测定了微囊藻水华水样经HG-16处理不同时间后,有机质组分的变化,用平行因子分析法(PARAFAC)分析三维荧光光谱数据,发现HG-16处理后,藻液的类腐殖质组分逐渐增加,而对照组的这一组分逐渐减少。2.HG-16对禾谷镰孢菌的生长、孢子萌发及DON毒素合成的影响研究。HG-16培养液的上清液能够有效抑制禾谷镰孢菌的孢子萌发以及菌丝的生长。通过扫描电镜观察,与对照相比,HG-16培养液上清导致禾谷镰孢菌的孢子表面发生皱缩、变形,使菌丝膨大、表面皱缩、断裂。HG-16显著抑制禾谷镰孢菌DON毒素的合成,用RT-q PCR分析DON合成相关基因发现,HG-16可能通过抑制DON合成关键酶tri5基因以及tri101基因的表达抑制DON的合成。3.优化HG-16发酵条件,提高HG-16无菌上清的溶藻活性。通过单因素实验,确定了硫酸铵作为氮源、可溶性淀粉作为碳源、氯化钠作为无机盐时,HG-16上清液具有更好的溶藻活性。使用软件design expert运用Plackett-Burman Design(PBD)试验设计,从可能影响HG-16上清液溶藻活性的7个培养条件中筛选出来3个较为显著的影响因子,分别为培养基的氮源含量、起始p H和摇床的转速。通过最陡爬坡试验确定了后续实验响应面中心点的位置,然后使用Box-Behnken Design(BBD)方法设计了响应曲面试验,对得到的响应面结果进行分析后得知模型存在极值点,影响因素最适配比为培养基起始p H为7.75,(NH4)2SO4含量为2.76 g/L,摇床转速为198.55 rpm时,HG-16上清液溶藻率达到极大值。通过代谢组学研究了不同条件下HG-16的胞外代谢物,其中发现了三种共有组分ipomeamaronol,testosterone glucuronide,leupeptin,它们以及其他代谢物的溶藻活性与拮抗活性有待进一步分析和确认。
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