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研究背景和目的：肝纤维化(liver-fibrosis)是慢性肝病向肝硬化转变的重要病理过程,其发生主要是与细胞外基质(ECM)成分的过度合成与异常沉积有关,其重点在于肝星状细胞(HSC)活化与增殖。近来研究表明,诸多肝损伤因素在其致病过程中均不同程度地伴有氧化应激(oxidative stress,OS)。ROS包括氧自由基及其歧化物,如羟自由基(.OH)、单线态氧自由基(02)及超氧阴离子自由基(02-)等等。血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)作为肾素-血管紧张素系统(RAS)中最主要的生物活性物质,在HSC活化、收缩、增殖过程中均起重要作用。电子自旋共振(ESR)是目前研究自由基最有效最准确的方法,采用自旋补集技术则可很好的完成自由基的测定,进而明确自由基进攻细胞膜引起细胞膜磷脂过氧化和膜蛋白构象改变的机制及药物抗氧化的保护机制。已有文献报道鳖甲煎口服液有抗肝纤维化作用。本实验通过ESR技术探索AngⅡ诱导人肝星状细胞(HSC-LX2)产生自由基的类型、通过给药时间的差异来观察鳖甲煎口服液对AngⅡ诱导人肝星状细胞(HSC-LX2)产生自由基的影响及其对ROS-(ACE-Ang Ⅱ-AT1R/ACE2-Ang(1-7)-Mas)相关通路的影响,为肝纤维化的临床早期干预提供新的思路。方法：利用Ang Ⅱ模拟氧化应激条件以诱导HSC-LX2细胞株增殖,用四甲基偶氮唑(MTT)比色法检测增殖情况,ESR捕获培养液中自由基以观察HSC-LX2增殖不同阶段自由基的特点,用蛋白芯片技术检测与HSC增殖及氧化应激相关的信号通路；采用免疫组化法检测ACE2、Mas及用RT-PCR法检测Mas、ACE2的表达。结果：Ang Ⅱ诱导HSC-LX2氧化应激时对细胞活力的影响：复苏后细胞生长良好；与正常组对比AngⅡ诱导HSC-LX2氧化应激时细胞活力水平提高(P<0.05)且呈浓度依赖关系。Ang Ⅱ诱导HSC-LX2氧化应激时产生的自由基类型：采用电子自旋共振仪及自旋捕集技术,利用多种自由基捕获剂捕捉HSC-LX2氧化应激时产生的自由基,与正常组比较,共产生两种类型自由基即单线态氧自由基和羟自由基。不同给药时间给药对细胞HSC-LX2氧化应激状态即自由基产生情况的影响：细胞氧化应激前给药与氧化应激后给药,对HSC-LX2因AngⅡ诱导氧化应激而产生的自由基均有一定抑制作用,但细胞发生氧化应激后给药,抑制作用更强。鳖甲煎口服液对Ang Ⅱ诱导HSC-LX2氧化应激时Ang Ⅱ、Ang(1-7)、ACE、ACE2、AT1R、Mas、蛋白表达位置及ACE2和Mas的mRNA表达的影响：与模型组对比,经鳖甲煎口服液干预后Ang(1-7)、ACE2、Mas蛋白表达位置明确且ACE2和Mas的mRNA表达差异明显。鳖甲煎口服液对血管紧张素2诱导HSC-LX2氧化应激时各通路的影响：利用蛋白芯片技术共作出可磷酸化结合点583个,其中,针对氧化应激并产生肝纤维化的磷酸化蛋白主要分布在MAPK通路,TGFβ-Smad通路,及NF-κB通路上,其中以MAPK通路上磷酸化靶点分布最多,为主要通路,BOL通过抑制JAK-STAT通路、TGFβ-Smad通路、MAPK通路及NF-κB通路的活化,激活Ang(1-7)水平进而抑制Ang Ⅱ产生ROS的水平以实现对抗肝纤维化的发生与发展。结合肝纤维化的发生机制,显示出ROS即自由基的产生与消除对肝纤维化的发生与治疗或预防过程中的突出重要地位,为临床肝纤维化的早期发现提供新的思路。结论：1、AngⅡ诱导HSC-LX2氧化应激时可产生两种自由基即羟自由基和单线态氧自由基；2、不同时间应用中药鳖甲煎口服液复方均可有效抑制AngⅡ诱导HSC-LX2氧化应激时产生的羟自由基,但对单线态氧自由基效果较弱；3中药鳖甲煎口服液复方在抑制细胞氧自由基的产生,拮抗ACE-Ang Ⅱ-AT1R轴的作用；同时,增强Ang(1-7)、ACE2及Mas受体的作用,即BOL通过抑制JAK-STAT通路TGFβ-Smad通路、MAPK通路NF-κB通路的活化,激活Ang(1-7)水平进而抑制AngⅡ产生ROS的水平以实现对抗肝纤维化的发生与发展。结合肝纤维化的发生机制,显示出ROS即自由基的产生与消除对肝纤维化的发生与治疗或预防过程中的突出重要地位,为临床肝纤维化的早期发现提供新的思路。