论文部分内容阅读
饲料氧化油脂对养殖鱼类健康和生长的毒副作用是一个急待研究的科学问题。饲料首先在肠道消化吸收，饲料氧化油脂及其主要成分首先会对肠黏膜产生损伤作用，如果肠黏膜屏障结构和功能维持正常状态，饲料氧化油脂的损伤作用就还只是肠道内的损伤作用，然而，当该屏障损伤时，细菌、类毒素等大分子物质则会通过屏障进入体循环，对远程实质性器官如肝胰脏造成打击。肠粘膜屏障的损伤主要表现为肠道通透性显著增加，肠道通透性增加的主要途径之一则是肠粘膜上皮细胞间的紧密连接蛋白合成受到影响，紧密连接出现结构性破坏。因此，本实验通过对草鱼中肠紧密连接结构观察、紧密连接蛋白基因的克隆和组织表达分析及中肠损伤后基因表达活性的分析，旨在证实草鱼中肠是否存在紧密连接结构并克隆获得紧密连接蛋白基因的片段序列，同时初步探讨养殖条件下可能存在的与草鱼中肠损伤密切相关的紧密连接蛋白基因。实验一草鱼中肠紧密连接结构观察通过透射电镜（TEM），观察草鱼中肠的紧密连接结构，结果显示：肠上皮细胞侧面存在高电子密度（黑色）连接线，高倍放大观察，能看到连接线处有致密的黑点。将其与已有的紧密连接TEM图对比，确定黑色连接线为肠道上皮细胞之间的连接，其顶部为紧密连接。结论：本实验首次观察到草鱼中肠的上皮连接结构，其顶端应为紧密连接结构，证实了草鱼中肠紧密连接结构的物理性存在。实验二草鱼紧密连接蛋白基因克隆和组织表达分析根据本实验室草鱼肠道转录组测序（RNA-Seq）结果，采用prime5.0设计引物，通过RT-PCR技术克隆草鱼Claudin-3、Claudin-12、Claudin-15a、Claudinb、Claudinc、Occludin、ZO-1、ZO-2isoform2、ZO-3基因片段序列，运用DANMAN进行片段序列的氨基酸推导和氨基酸同源性分析，确定所克隆基因为紧密连接蛋白基因的组成，证实了草鱼中肠紧密连接结构的存在。同时，采用荧光定量PCR（Q-RT-PCR）分析各紧密连接蛋白基因在草鱼脾脏、肝胰脏及中肠的表达情况。结果表明：（1）克隆获得草鱼Claudin-3基因片段序列长1263bp，编码131个氨基酸，氨基酸序列分析表明草鱼Claudin-3基因与其他物种的相似性在60%-88%之间；克隆获得草鱼Claudin-12基因片段序列长235bp，编码23个氨基酸，氨基酸序列分析表明草鱼Claudin-12基因与其他物种的相似性在78%-100%之间；克隆获得草鱼Claudin-15a基因片段序列长490bp，编码151个氨基酸，氨基酸序列分析表明草鱼Claudin-15a基因与其他物种的相似性在50%-92%之间；克隆获得草鱼Claudinb基因片段序列长776bp，编码195个氨基酸，氨基酸序列分析表明草鱼Claudinb基因与斑马鱼和鲫鱼的相似性分别为84%、89%；克隆获得草鱼Claudinc基因片段序列长662bp，编码171个氨基酸，氨基酸序列分析表明草鱼Claudinc基因与斑马鱼和鲫鱼的相似性分别为95%、91%；克隆获得草鱼Occludin基因片段序列长1183bp，编码375个氨基酸，氨基酸序列分析表明草鱼Occludin基因与其他物种的相似性在37%-88%之间；克隆获得草鱼ZO-1基因片段序列长279bp，编码93个氨基酸，氨基酸序列分析表明草鱼ZO-1基因与其他物种的相似性在46%-88%之间；克隆获得草鱼ZO-2isoform2基因片段序列长762bp，编码248个氨基酸，氨基酸序列分析表明草鱼ZO-2isoform2基因与其他物种的相似性在44%-89%之间；克隆获得草鱼ZO-3基因片段序列长419bp，编码139个氨基酸，氨基酸序列分析表明草鱼ZO-3基因与其他物种的相似性在57%-82%之间。（2）Q-RT-PCR分析表明草鱼脾脏、肝胰脏和中肠中各细胞质蛋白基因和跨膜蛋白基因均有表达，且依次呈现出表达总量逐步增加，主要表达类型逐步多元化，即脾脏以ZO-1和Claudin-12表达为主，肝胰脏以ZO-2isoform2、ZO-3和Claudin-12、Claudin-3表达为主，中肠以ZO-1、ZO-2isoform2、ZO-3和Claudinc、Claudin-15a、Claudin-12、Occludin表达为主。实验三养殖条件下草鱼中肠损伤后各紧密连接蛋白基因表达活性分析本实验采用Q-RT-PCR检测了养殖条件下草鱼中肠损伤后各紧密连接蛋白基因的mRNA相对表达水平。结果显示：草鱼中肠损伤后，ZO-1表达上调，但差异不显著；Claudinb、Claudin-15a、ZO-2isoform2、ZO-3表达下调，但差异不显著；Claudinc、Claudin-3、Claudin-12表达分别显著下调了153、115和1倍。结论：养殖条件下草鱼中肠损伤后，各紧密连接蛋白基因的表达活性均受到了影响，进一步证实了草鱼肠道紧密连接结构的存在，其中，Claudinc、Claudin-3、Claudin-12表达显著下调，可能与草鱼中肠损伤密切相关。