[目的]阿尔茨海默病(AD)的加剧及其引发的并发症目前已经导致了诸多老年人的死亡,成为致老年人死亡的四大病因之一,老龄化社会的愈演愈烈使得AD的患病人数逐步增长,病死率持续升高,因此AD目前是受到各领域广泛关注的一项世界性难题。目前AD的成因及发病机制尚未完全明朗,缺少理想的预防和治疗措施,现有的治疗药物无法彻底治愈AD,只能改善其一部分临床症状,减缓疾病进展。糖原激酶合成酶3(GSK-3)在体内分布广泛,与神经系统疾病的发生发展关系密切。GSK-3β与AD发病机制中的各个假说均有关联,是各个病因之间的联结分子,是当前AD药物研发的热门靶点。新型GSK-3抑制剂9b创新性的作用于金属离子失衡和氧化应激靶点,在体外细胞实验中取得了良好的改善氧化应激的效果。本实验选取SD大鼠作为实验动物,采用海马CA1区内微量注射Aβ的方法构造AD模型,选用盐酸多奈哌齐作为阳性对照药物,使用新型GSK-3抑制剂9b对模型大鼠进行灌胃治疗。通过水迷宫实验、三磷酸腺苷酶(ATPase)活性测定、抗氧化系统各项指标水平测定、乙酰胆碱酯酶(AChE)和总一氧化氮合酶(NOS)活力值测定以及神经递质水平变化的检测,研究新型GSK-3抑制剂9b对AD模型大鼠的认知功能障碍和过氧化损伤的作用并探讨其机制。[方法]1.实验动物选取50只体重为(180～220g)的SPF级健康雄性SD大鼠,待其适应新的生长环境后按照体重随机划分成模型组、药物对照组、9b低剂量组、9b高剂量组和阴性对照组五个组别,每个组别纳入10只健康大鼠。使用10%水合氯醛麻醉后向CA1区内注射10μg Aβ1-42以建造AD模型,术后肌注青霉素抗感染。模型诱导成功后选择一日进行一次胃内给药的方式对实验大鼠施行干预治疗,9b低剂量组与9b高剂量组各自给予9b混悬液6 mg/(kg·d)和18 mg/(kg·d),药物对照组选用多奈哌齐混悬液作为干预药物,给药剂量为12mg/(kg·d),选取0.5%羧甲基纤维素钠作为剩余两组的干预试剂,给药体积定为1mL,干预周期为28日。给药结束后进行Morris水迷宫实验,撤去饲料正常饮水,24h后剪头进行处死,取血并分离出脑组织。2.动物生长发育状况评价记录实验动物的生长速度、发育程度、日常生活状态及每周的重量,称量分离出的脑组织的重量,结合大鼠处死前的体重获得脑系数。3.Morris水迷宫实验给药28天后进行定位航行实验和空间探索实验,分别记录前四天实验动物每天的总路程及逃避潜伏期以评价其空间学习能力,对第5天实验动物的穿越平台次数进行计算分析,评估其学习记忆的保持能力。4.AD模型大鼠大脑皮质中抗氧化系统各项指标水平变化的测定将实验动物大脑皮层与生理盐水混合处理,制备成10%的脑匀浆液,根据各个测试盒说明上的操作步骤进行预试,并对实验动物大脑皮层中总蛋白(TP)和丙二醛(MDA)的水平变化以及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和超氧化物歧化酶(SOD)的活性变化进行分析评估。5.AD模型大鼠血清抗氧化系统各项指标水平变化的测定选择断头的方式处死实验动物,采集颈动脉血,冷藏放置使其血凝后进行离心,根据测试盒说明书上的操作过程进行预试并对实验动物血清中的GSH-Px和SOD活性变化及MDA的水平变化进行检测分析。6.AD模型大鼠大脑皮质中ATP酶(ATPase)活力值的测定将实验动物大脑皮质与生理盐水混合处理成10%的组织匀浆,根据试剂盒说明步骤对其中的Mg2+-ATPase、Na+K+-ATPase和Ca2+-ATPase的活力值进行定量分析。7.AD模型大鼠大脑皮质中乙酰胆碱酯酶(AChE)和总一氧化氮合酶(NOS)活力值的测定将实验动物大脑皮层处理成10%的组织匀浆,根据试剂盒操作步骤对其中的AChE和NOS的活力值进行定量分析。8.AD模型大鼠大脑皮质中单胺类神经递质水平变化的测定将大鼠大脑皮质与0.1 mol/L的高氯酸混合制成10%的脑组织匀浆液,使用高效液相色谱法(荧光检测法)对大鼠大脑皮质中的儿茶酚乙胺(DA)、肾上腺素(E)、去甲肾上腺素(NE)和5-羟色胺(5-HT)等4种单胺类神经递质进行定量分析。9.AD模型大鼠大脑皮质中氨基酸类神经递质水平变化的测定将大鼠大脑皮质与50%的乙腈溶液混合制成10%的组织匀浆,与0.5 mol/L的碳酸氢钠溶液和0.5%的2,4-二硝基氟苯(DNFB)溶液混匀,于黑暗条件下衍生转化后,使用高效液相色谱仪(光电二极管列阵检测器)定量检测分析大鼠大脑皮质中的天门冬氨酸(Asp)、牛磺酸(Tau)、谷氨酸(Glu)、γ-氨基丁酸(γ-GABA)及甘氨酸(Gly)的水平变化。[结果]1.新型GSK-3抑制剂9b对AD模型大鼠一般生长发育状况的影响阴性对照组大鼠在实验干预阶段生长迅速、发育正常、精神稳定。模型组大鼠在给药后期出现大便干燥、腹部肿胀、毛发粗糙无光泽、且脱毛严重等症状并伴随运动量及饮食量减少。干预治疗期间各组实验动物的体重均呈现逐步增长趋势,各组之间体重变化无显著差异(P>0.05),通过将模型组的体重增长情况与其他组对比,发现其有下降趋势。各处理组大鼠脑组织系数两两对比未发现显著差异(P>0.05)。2.新型GSK-3抑制剂9b对AD模型大鼠认知功能障碍的影响对定位航行实验的结果进行分析可知,各处理组实验动物的游泳总路程和逃避潜伏期整体减少。自第三天开始,模型组的总路程和逃避潜伏期与阴性对照组相比显著增加(P<0.01);以模型组为对照进行两两比较发现,药物对照组、9b低剂量组及9b高剂量组的总路程和逃避潜伏期明显减少(P<0.05)。对空间探索实验的数据进行分析,模型组大鼠穿越原平台所在位置的次数与阴性对照组相比明显下降(P<0.05);以模型组为对照进行比较发现,药物对照组和9b高剂量组大鼠穿越原平台所在位置的次数明显增多(P<0.05)。3.新型GSK-3抑制剂9b对AD模型大鼠大脑皮质抗氧化系统的影响与阴性对照组进行比较,模型组大鼠大脑皮质内的GSH-Px和SOD活性均明显下降(P<0.05)、(P<0.01),而MDA的水平明显升高(P<0.01)。与模型组比较发现,9b高剂量组大鼠大脑皮层内GSH-Px与SOD的活性明显升高(P<0.05),MDA含量显著下降(P<0.01);低剂量的9b能明显提高大鼠大脑皮层内GSH-Px的活力(P<0.05)并降低MDA的含量(P<0.01)。4.新型GSK-3抑制剂9b对AD模型大鼠血清抗氧化系统的影响与阴性对照组比较发现,模型组大鼠血清内GSH-Px及SOD的活性明显降低(P<0.05)、(P<0.01),而MDA的水平明显升高(P<0.05)。与模型组相比,药物对照组及9b高剂量组大鼠血清内GSH-Px与SOD的活性明显升高(P<0.05),MDA含量显著降低(P<0.05);低剂量的9b对实验大鼠血清内的GSH-Px活力(P<0.05)与SOD活力(P<0.01)具有明显的升高作用,并能显著减低MDA的水平(P<0.05)。5.新型GSK-3抑制剂9b对AD模型大鼠大脑皮质中ATPase活力的影响与阴性对照组相比,模型组大鼠大脑皮质中Na+K+-ATPase活性(P<0.05)、Ca2+-ATPase和Mg2+-ATPase活性显著减弱(P<0.01);以模型组为对照进行比较发现,高剂量的9b能显著增强实验大鼠大脑皮层中的Na+K+-ATPase活性(P<0.05)、Ca2+-ATPase 活性和Mg+-ATPase 活性(P<0.01);9b 低剂量组大脑皮层中Mg+-ATPase的活性得到明显提升(P<0.05)。6.新型GSK-3抑制剂9b对AD模型大鼠大脑皮质内AChE和NOS活力的影响与阴性对照组比较发现,模型组大脑皮质中的AChE活力明显降低(P<0.05),NOS活力明显升高(P<0.01)。以模型组为对照进行比较发现,药物对照组和9b高剂量组大鼠大脑皮质中的AChE活性明显增强(P<0.05),NOS活性显著降低(P<0.05);而低剂量的9b对大鼠大脑皮质内AChE和NOS的活力变化无显著影响(P>0.05)。7.新型GSK-3抑制剂9b对AD模型大鼠大脑皮质中神经递质水平变化的影响7.1对单胺类神经递质水平变化的影响与阴性对照组进行比较,模型组大脑皮质内NE的水平显著下降(P<0.05),DA含量明显降低(P<0.01),5-HT含量显著增加(P<0.01)。与模型组相比,9b高剂量组大鼠大脑皮质内5-HT的水平显著下降(P<0.01);低剂量的9b对大鼠大脑皮质内各类单胺类神经递质的水平变化无明显影响(P>0.05)。7.2对氨基酸类神经递质水平变化的影响与阴性对照组相比,模型组大脑皮质内Asp、Gly的水平(P<0.05)、Tau、γ-GABA的水平显著上升(P<0.01),Glu水平显著下降(P<0.01)。与模型组比较发现,9b能显著减低大脑皮质内Gly、γ-GABA的水平(P<0.05)。[结论]新型GSK-3抑制剂9b能够通过靶向氧化应激,改善胆碱能神经系统紊乱,调节神经递质水平等多靶点多环节改善AD大鼠的认知功能障碍及过氧化损伤,从而发挥抗AD作用。