睾丸发育和精子发生的正常进行对优良种公畜繁殖力和保障种群延续至关重要,但公畜生殖力下降甚至不育的状况在当前畜牧业中十分普遍。哺乳动物精子发生的源头是精原干细胞（Spermatogonia stem cells,SSCs）,SSCs的增殖和分化正常维持对于精子发生具有决定性作用。因此,探究睾丸发育和精子发生过程对雄性生殖力的维持以及种质资源保护等具有重要作用。在我国春冬季节饲料资源缺乏和夏季高温高湿环境饲料易霉变的环境都影响公畜的健康生长。营养缺乏和霉菌毒素都会使动物机体产生应激反应,破坏机体代谢平衡。代谢平衡对于维持细胞的正常生理状态及人和哺乳动物机体健康至关重要。在体内,机体能够通过细胞自噬清除受损的细胞器、蛋白质等循环营养物质以适应不利环境,是一种高度保守的细胞自我保护途径。UNC-51样激酶1（UNC-51-like kinase 1,ULK1）是自噬过程必需的蛋白,诱导自噬体形成。研究显示,5’AMP激活的蛋白激酶（The 5’AMP-activated protein kinase,AMPK）是真核细胞中高度保守的丝氨酸/苏氨酸（Ser/Thr）蛋白激酶,也是调节能量稳态和代谢应激的主要传感器。它参与细胞生长、增殖、自噬和凋亡等基本生理过程。在能量不足时,AMPK抑制哺乳动物雷帕霉素蛋白激酶复合体1（Mammalian target of rapamycin complex 1,mTORC1）激活ULK1复合体以诱导自噬,且AMPK也可直接磷酸化ULK1促进自噬。然而,目前AMPK-ULK1介导的细胞自噬通路参与调控公羊睾丸发育以及SSCs增殖分化的研究鲜有报道。因此,本研究以AMPK-ULK1信号通路为核心,研究公羊体内能量缺乏和氧化应激条件下自噬水平的变化,揭示AMPK-ULK1自噬信号通路在公羊睾丸发育及SSCs中的作用机制,为丰富和完善雄性动物生殖生理的分子调控理论奠定基础。试验一、能量限制对公羊睾丸发育的影响研究选取24只体况相似（22.02±0.14 kg）、健康的3月龄雄性湖羊随机分为三组:C组（100%能量,对照组,n=8）、15%ER（15%能量限饲,n=8）和30%ER（30%能量限饲,n=8）,限饲60d后,每组各屠宰4只（n=4）,进行称重、采集血液和睾丸组织。未屠宰的12只能量限制组公羊进行100%能量补饲,分别为C组（100%能量,对照组,n=4）、15%ER-C（15%能量限饲后补饲,n=4）和30%ER-C（30%能量限饲后补饲,n=4）。90d后称重、采集血液和睾丸组织（n=4）。通过ELLSA法、HE染色、qRT-PCR和Westem-blot等方法,进行血浆睾酮水平、组织形态及自噬和凋亡相关基因和蛋白表达水平的研究。结果表明:随着能量限制水平升高,睾丸重量显著减少（P<0.05）,睾丸脏器指数呈下降趋势（P>0.05）,生精细胞数量和类型明显减少;能量限制组Beclin1和微管相关蛋白 1 轻链 3（Microtubule-associated protein 1 lightchain3,LC3）mRNA 和蛋白水平表达显著上升,LC3Ⅱ/Ⅰ比率显著升高（P<0.05）;与对照组相比,能量限制组的BCL2相关X蛋白（Bcl-2-associated X protein,BAX）/B细胞淋巴瘤因子 2（B-celllymphoma2,Bcl-2）的 mRNA 和蛋白水平显著升高（P<0.05）。但在能量补偿后,睾丸重量、睾丸脏器系数和睾酮水平恢复到对照组水平（P>0.0 5）;ER-C 组 Beclin1 蛋白表达和 LC3Ⅱ/Ⅰ比率均下调（P<0.05）,BAX/Bcl-2mRNA和蛋白水平也显著降低（P<0.05）。综上所述,能量限制诱导性成熟前公羊睾丸组织中自噬和凋亡水平的升高,抑制公羊睾丸的发育。此外,补饲后限制组公羊睾丸各项指标恢复到正常水平,其中可能存在的机制需要进一步研究。试验二、AMPK-ULK1自噬通路在能量限制影响公羊睾丸发育的作用研究通过将实验一中采集的公羊睾丸组织进行免疫组织化学法（IHC）定位p-AMPK（Thr172）在睾丸组织中的分布情况;通过qRT-PCR和Western-blot等方法检测能量限制组和能量补偿组睾丸组织中AMPK信号通路上下游相关的基因和蛋白的表达变化。结果显示:p-AMPK（Thr172）主要定位于生精细胞的细胞核中;与对照组相比,能量限制组激酶肝脏激酶B1（Liver kinase B1,LKB1）、AMPK和 ULK1 mRNA 表达水平显著增加（P<0.05）,AMPK、p-AMPK 和 ULK1蛋白表达升高（P<0.05）;能量补偿后LKB1 mRNA和p-AMPK、ULK1蛋白表达显著降低（P<0.05）,而AMPK mRNA表达在30%ER-C组中显著增加（P<0.05）,AMPK的蛋白在所有ER-C组中表达显著升高（P<0.05）。综上所述,能量不足激活LKB1,进而激活AMPK信号通路,上调ULK1的表达,诱导自噬的发生,抑制公羊睾丸组织的发育。补饲后,能量限制组AMPK的上游基因LKB1及p-AMPK蛋白表达降低,说明能量补偿可能通过AMPK-ULK1通路下调自噬和凋亡水平,进而促进能量限制组睾丸恢复正常。试验三、AMPK-ULK1自噬通路在氧化应激影响公羊睾丸精原干细胞的作用研究通过不同浓度HT-2毒素体外处理公羊精原干细胞12h后,筛选适宜浓度进行后续试验。使用筛选后浓度的HT-2毒素处理公羊精原干细胞12h后,检测细胞内ROS水平、抗氧化酶谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione Peroxidase,GSH-px）、超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase,SOD）和过氧化氢酶（Catalase,CAT）的活性、氧化产物丙二醛（Malondialdehyde,MDA）含量、SSCs增殖和分化相关基因的表达水平、细胞自噬和凋亡相关基因mRNA与蛋白的表达变化,进一步检测了自噬和凋亡上游调控中枢AMPK-mTOR通路的变化。结果显示:在80 nM时细胞活力下降至60%左右,选取HT-2毒素80 nM浓度进行后续试验。与对照组相比,处理组ROS水平显著升高（P<0.05）,抗氧化酶GSH-px、SOD和CAT活性显著升高（P<0.05）,脂质氧化产物MDA的含量显著上升（P<0.05）;处理组SSCs增殖和分化相关基因PLZF、GFRA1以及DAZL的mRNA表达水平显著低于对照组（P<0.05）;处理组中p-AMPK/AMPK、p-Raptor/Raptor 和 p-ULK1/ULK1 比率显著升高（P<0.05）,p-mTOR/mTOR 比率显著降低（P<0.05）。检测到处理组自噬标记蛋白Beclin1和LC3Ⅱ/Ⅰ的比率显著升高（P<0.05）,p62蛋白显著降低（P<0.05）,吞噬泡和自噬体数量增多。处理组凋亡相关蛋白BAX/Bcl-2表达水平显著升高（P<0.05）,线粒体膜电位降低;综上所述,HT-2毒素引起精原干细胞氧化损伤,激活AMPK-mTOR-ULK1通路,进而诱导自噬和凋亡的发生,自噬和凋亡相互作用,最终决定细胞命运。