第一部分精子DNA损伤患者精浆中相关miRNA的筛选　　目的：在精子DNA损伤高的患者精浆中，对18个睾丸来源精浆miRNA的含量进行筛选，从而筛选出和精子DNA损伤相关的miRNA。　　方法：在对1090名男性不育患者经病例筛选排除年龄（>35岁）、环境因素、精液常规异常后，对筛选后的病例进行精子染色质完整性检测（SCSA），并根据DFI值将病例分为精子DNA损伤严重的高DFI组（DFI>30％）和精子DNA损伤较低的低DFI组（DFI<15%）。两组间先选出24例，用real-time PCR的方法检测精浆中miRNA的含量，对前期筛选出的18个睾丸特异性miRNAs进行筛查。两组再新选出余下的匹配的病例，用相同的检测方法对于筛选出差异的miRNAs进行验证。　　结果：经病历筛查和精液常规检测后的排除，筛选出的698例进行了SCSA检测，其中高DFI组94例，中等DFI组224例，低DFI组380例。在选出的24个相匹配的高DFI组和低DFI组病例中，18个睾丸miRNA在两组精浆中的含量大部分相同，但其中miR-15b含量上调，而miR-29c和miR-424的含量下调。余下的70例高DFI组病例与低DFI组的70人相匹配后作为验证组，筛选出的3个差异的miRNA在验证组中进行检测，发现miR-29c和miR-424和筛选的结果一致，都在高 DFI组中显著降低，而 miR-15b与筛选的结果不一致，因此排除进行后续的实验。进一步 ROC曲线显示 miR-29c和miR-424对高 DFI组和低DFI组有较好的区分度。　　结论：在精子DNA损伤高的患者中，筛选出了与人精子DNA损伤相关的睾丸特异性miRNA——miR-29c和miR-424。　　第二部分候选miRNA相关性，保守性和在小鼠睾丸内的表达　　目的：对第一部分筛选出的2个候选miRNA，检测其在临床保存状态下的稳定性和在精浆与睾丸中的相关性，并检验其物种保守性和在小鼠睾丸细胞中的分布，为下一部分的动物实验奠定基础。　　方法：选择8个高DFI组和低DFI的标本，在室温放置24h或在4℃放置48h，分4个时间点检测miRNA含量的变化。选择8例无精子症患者的睾丸和精浆相对应的标本，检测其含量并做相关性分析。通过数据库分析小鼠和人的 miRNA的保守性。分离小鼠睾丸的精母细胞和支持细胞，并检测其中候选miRNA的表达。　　结果：高DFI组或低DFI组的精液液化后，在室温放置24h，在0.5h，2h，5h，24h检测，含量都没有发生显著变化，或者在4℃放置48h，在0.5h，12h，24h，48h检测，含量也没有发生显著变化。对8例无精子症患者中，miR-424和miR-29c在睾丸和精浆中含量的相关性分析显示具有高相关性（R=0.789，P=0.020;R=0.773，P=0.024）。生物信息学分析miR-29c和miR-424在人和小鼠中有良好的保守性，其成熟序列基本一致。候选miRNA在小鼠睾丸中丰富表达，在精母细胞和支持细胞中都有表达，且精母细胞中表达更丰富些。　　结论：miR-424和miR-29c在精浆中稳定存在，在物种间保守性好，在睾丸和精浆中的含量有较高相关性，并在小鼠睾丸中丰富表达，为下一步的动物实验奠定基础。　　第三部分候选miRNA在小鼠睾丸中对精子DNA损伤的作用　　目的：通过小鼠实验，证实候选 miRNA在睾丸内低表达后，对小鼠精子 DNA损伤的作用，并初步讨论小鼠体内的损伤机制。　　方法：合成候选的miR-29c和miR-322的反向互补序列，构建入慢病毒载体质粒，再与慢病毒包装质粒共转染病毒包装细胞293T，48h后收集上清浓缩并测定滴度。制作显微注射针，在体视镜下注射10μl慢病毒载体到小鼠右侧睾丸的睾丸网，阴性对照注射对照miRNA慢病毒载体，空白对照注射PBS。通过共注射的台盼蓝检测显微注射效果，3天后睾丸切片观察慢病毒载体的感染效果。注射21天后从小鼠附睾取精子，镜下观察小鼠精子的浓度，活率和前向运动率，SCSA检测小鼠精子 DNA损伤的情况，HE染色检测睾丸组织形态，同时免疫荧光染色检测睾丸γH2AX的表达。　　结果：成功构建了抑制miR-29c和miR-322的慢病毒载体质粒并测序验证，滴度达到1X108以上。显微注射的慢病毒感染了30%-60%的生精小管，并在注射3天后的切片观察到GFP的表达。21天后观察，与对照相比小鼠附睾精子的浓度、活率和前向运动率没有明显变化，睾丸组织形态也未损伤，但注射了抑制miR-322慢病毒组的小鼠精子DNA损伤明显增加，而注射了抑制miR-29c慢病毒组的小鼠精子 DNA损伤未增加。同时在睾丸中，抑制 miR-322表达增加了γH2AX的表达，而抑制miR-29c表达未见γH2AX的变化。　　结论：在小鼠睾丸中下调miR-322的表达可以引起小鼠精子DNA损伤，会引起睾丸中γH2AX的表达增加。　　第四部分 miR-322靶基因的预测、鉴定及对精原细胞系的表达调控　　目的：预测和验证miR-322的靶基因，并在精原细胞系中验证miRNA对靶基因的作用。　　方法：利用生物信息学数据库，预测miR-322的靶基因，进行GO分析，将候选的靶基因的3’-UTR区的野生型序列和突变型序列分别构建到荧光素酶载体中，利用lipo2000转染293T细胞，48h后利用试剂盒对细胞的荧光素酶活性进行检测。培养精原细胞系GC-2，用miR-322的慢病毒抑制剂和对照的慢病毒，miR-322 mimic和对照mimic进行转染，western blot检测候选靶基因蛋白的表达。　　结果：经 miRNA靶基因数据库的分析，构建了 chk1的野生型和突变型的荧光素酶载体，并检测到miR-322可以明显降低chk1的野生型载体的荧光素酶强度，而不能降低突变型的强度，验证了chk1是miR-322的靶基因。western blot检测显示在GC-2细胞系中抑制miR-322表达可上调chk1的表达，而增加miR-322的表达可以抑制chk1的表达。　　结论：鉴定出了miR-322的靶基因chk1，并证实在精原细胞系中miR-322和chk1表达负相关。