论文部分内容阅读
为解决新疆棉田长期滴灌出现的土壤次生盐渍化问题,本论文以新疆不同生态环境的次生盐渍化土壤中自行筛选得到几株对棉花种子发芽和苗期生长具有显著促生功能的解盐促生菌产酸克雷伯氏菌Klebsiella oxytoca Rs-5（Genebank登录号为EF551363）及恶臭假单胞菌Pseudomonas putida Rs-198 （Genbank登录号为FJ788425）为对象,开展ACDS基因的克隆、载体构建及遗传转化研究,获得主要结果如下:根据Genbank上已报道的ACC脱氨酶基因序列设计并合成一对简并引物,以产酸克雷伯氏菌Rs-5基因组为模板,PCR扩增获得一条约1.0kb的特异片段。序列分析表明此基因具有完整的开放阅读框,编码区全长为1017bp,共编码338个氨基酸残基。由该基因（命名为Koacds）的DNA序列推导出的氨基酸序列与阴沟肠杆菌Enterobacterc loacae UW4和CAL2的ACC脱氨酶同源性分别为95.56%和96.75%。将上述基因与大肠杆菌-假单胞菌穿梭质粒pDSK519连接,构建重组表达载体pDSK519-Koacds并转入大肠杆菌BL21中,获得的重组菌株命名为BL21-Koacds。全细胞蛋白电泳分析表明ACC脱氨酶基因已在重组基因工程菌中成功表达,且利用0.4mM的IPTG于25℃诱导5h后,蛋白表达量最大,比酶活可达0.192±0.042U/mg。通过电转化法将重组质粒导入到恶臭假单胞菌Rs-198并对转化效率的影响因素进行了研究。结果表明,以OD600值为0.5的恶臭假单胞菌P. putida Rs-198细胞,在低温条件下制备感受态细胞(浓度为4.6×1012/ml ),并以0.3M的蔗糖为电转化介质,在13kV/cm的场强下电击可获得较高的转化效率,最高可达1.3×107个转化子/μg DNA。重组菌株198-Koacds在28℃经0.4mM IPTG诱导5h后,SDS-PAGE电泳检测其蛋白表达量最大,此时比酶活为0.167±0.028U/mg。用转入ACC脱氨酶的重组菌株198- Koacds处理棉花种子,通过检测其发芽率、干重及株高等指标验证重组菌株的解盐促生能力。结果显示在NaCl浓度为0.7%时,产酸克雷伯氏菌Rs-5、恶臭假单胞菌Rs-198及重组菌株198-Koacds使棉花的发芽率分别平均提高了15.9%、16.8%及16.7%;棉花的干重分别平均提高了30.6%、31.0%及32.1%;棉花的株高分别平均提高了10.8%、13.6%及12.2%。利用野生型恶臭假单胞菌P. putida Rs-198与重组菌株198-Koacds ACC脱氨酶粗酶液混合处理棉花后,其发芽率提高了28.6%,表明ACC脱氨酶具有一定的解盐促生功能。重组菌株在LB培养基中及棉花根部的质粒稳定性试验结果表明:空质粒pDSK519与带有ACDS基因的重组质粒pDSK519-Koacd在LB培养基中经连续传代60小时后质粒丢失率基本达到稳定,在连续培养96小时后未丢失质粒所占百分比分别为68%和65%;而在植物根部连续传代96小时后两质粒几乎全部丢失。