背景肺癌是最常见的恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率居各类肿瘤之首,是严重威胁人类健康与生命的恶性肿瘤。我国是烟草消费大国,特别是近年来,随着我国工业化进程的加速,空气污染日趋严重,肺癌发病不容乐观。据我国近期公布的中国肿瘤发病率和死亡率统计数据显示,肺癌是我国发病率最高的癌症,并呈现较快的增长趋势,是严重危害我国城乡人口健康的重大疾病。吸烟被认为是引起肺癌最重要的环境因素,据有关数据报道,吸烟者肺癌的发生风险较非吸烟者高近10倍,而及时戒烟可降低肺癌发生率。香烟烟雾中含有数千种化学物质,其中包含多种致癌物质,如芳香烃类、N-亚硝胺类、杂环胺、甲醛等,同时还包含一氧化氮、一氧化碳、硫化氢等在内的多种有害气体及重金属和放射性物质。此外,二手烟暴露亦被认为是肺癌发生的重要环境因素,二手烟中含有苯并芘、N-亚硝胺等在内的250余种有毒有害物质。吸烟被认为具有诱导生命体抗氧化能力下降和干扰DNA损伤修复能力,最终导致肿瘤、心血管系统疾病、神经退行性病变等多种疾病的发生。DNA是染色体主要组成成分,是生命体主要遗传物质,其分子结构完整性和稳定性是维持细胞正常生理功能的基础。各种内源性和外源性因素均可引起DNA损伤,DNA损伤后细胞启动修复或诱导凋亡。然而,当细胞对DNA损伤修复的异常反应可导致基因组的不稳定,最终导致肿瘤的发生。吸烟是肺癌最重要的危险因素,然而吸烟引起肺癌的机制仍不清楚。本研究拟探讨香烟烟雾暴露与气道上皮细胞DNA损伤修复的潜在联系,从而为肺癌的防治提供实验数据。第一部分香烟烟雾暴露诱导气道上皮细胞DNA损伤反应目的：探讨香烟烟雾暴露是否可诱导气道上皮细胞DNA损伤反应(DDR),并进一步探讨气道上皮细胞的DNA损伤修复机制。方法：香烟烟雾提取物(CSE)干预人体正常气道上皮细胞HBE,利用流式细胞技术、克隆形成实验和CCK8法检测CSE对HBE细胞增殖和凋亡的影响。分别利用β-半乳糖苷酶染色、免疫荧光染色法和吉姆萨染色法,观察CSE干预HBE后细胞的衰老反应、DDR和染色体结构。流式细胞技术检测CSE干预对HBE的细胞周期影响。DNA纤维形成实验探讨香烟烟雾暴露后气道上皮细胞DNA复制速度变化。Western Blot分析CSE干预后,DNA损伤修复蛋白XRCC1、RPA、USP1及范可尼家族蛋白的表达水平,Q-PCR方法观察HBE细胞经香烟烟雾暴露后FANCD2、FANCI的nRNA表达。结果：CSE可抑制HBE细胞增殖、诱导HBE细胞凋亡,并呈现浓度和剂量依赖效应。HBE细胞经CSE干预后染色体断裂增加,细胞核出现明显的DDR。但本实验条件下,未观察到CSE诱导的HBE细胞衰老反应。CSE作用HBE细胞后,G1期细胞数量增加,且DDR多发生于Cyclin A阳性细胞,提示DDR发生可能与DNA复制相关。DNA纤维形成实验表明,CSE干预后HBE细胞DNA复制速度下降,多集中在0.2kb/min-0.8kb/min,而对照组DNA复制速度主要分布于0.6kb/min-1.2kb/min。此外,CSE可诱导气道上皮细胞中范可尼家族蛋白FANCD2和FANCI的表达下调。结论：香烟烟雾暴露可降解FANCD2、FANCI蛋白,诱导气道上皮细胞DDR。第二部分IL-17促进香烟烟雾暴露诱导的基因组不稳定和DNA损伤反应目的：探讨IL-17是否参与了香烟烟雾暴露诱导的基因组不稳定和DNA损伤反应(DDR)。方法：C57BL/6小鼠与IL-17-/-小鼠分别随机分成香烟烟雾暴露组与对照组,每组数量在10只以上,实验组小鼠置于香烟烟雾暴露装置中(Teague Enterprises)。每日香烟烟雾暴露总量为100支,每周暴露5天。暴露12周后,收集小鼠肺泡灌洗液(BALF)和肺、脑、食管、心脏、肝脏、脾、肾、胃、肠、膀胱组织。流式细胞技术检测小鼠BALF中细胞DDR, HE染色观察小鼠各脏器病理形态学变化,免疫组织化学染色法(IHC)观察各脏器的DDR,并检测IL-17的表达及其与DDR的相关性。免疫荧光染色分析IL-17干预后HBE细胞的DDR,并探讨ATM与ATR是否参与了IL-17诱导的DDR。IHC观察吸烟与不吸烟者肺组织和膀胱组织DDR与IL-17表达,并分析二者的相关性。结果：香烟烟雾暴露12周后,C57BL/6小鼠肺和膀胱组织出现DDR,而脑、食管、心脏、肝脏、脾、肾、胃、肠组织均未发生明显的DDR, HE染色提示香烟烟雾暴露引起肺组织炎症细胞浸润,肺组织DDR与炎症评分有潜在联系。香烟烟雾暴露C57BL/6小鼠后,肺组织和膀胱组织IL-17表达上调,且与DDR呈正相关。香烟烟雾暴露IL-17-/-小鼠12周后,其肺组织DDR较香烟烟雾暴露的野生型小鼠明显下降。IL-17可体外诱导HBE细胞DDR, ATM与ATR抑制剂可有效阻断IL-17诱导的HBE细胞H2AX磷酸化。与不吸烟者相比,吸烟者肺组织和膀胱组织DDR与IL-17表达增高,且二者之间存在显著的相关性。结论：IL-17促进了香烟烟雾暴露诱导的多脏器基因组不稳定与DDR。第三部分吸烟诱导的氧化应激DNA损伤反应与肺癌高度相关目的：探讨吸烟与不吸烟肺癌和非癌对照患者肺组织氧化应激DNA损伤反应水平。方法：免疫荧光染色观察CSE干预气道上皮细胞后8-OHdG的表达水平变化。C57BL/6小鼠随机分组,实验组小鼠置于香烟烟雾暴露装置中。香烟烟雾分别暴露12周与24周后,收集肺组织标本。同时,收集88例因肺部疾病行气管镜检查的患者肺泡灌洗液(BALF),并收集病人一般资料。所有纳入研究者均获得病理学诊断,其中有50例肺癌患者和38例良性对照,两组之间在性别、年龄、吸烟史上无明显统计学差异。ELISA法检测BALF中8-OHdG表达水平,免疫组织化学染色(IHC)法评价肺组织8-OHdG表达水平,分别比较吸烟与不吸烟的肺癌及非癌对照患者肺组织的氧化应激DNA损伤反应。结果：体内外实验表明,香烟烟雾暴露诱导HBE细胞和小鼠肺组织8-OHdG表达增加,暴露24周小鼠比12周小鼠的肺组织存在更高的氧化应激DNA损伤反应。肺癌患者BALF中8-OHdG浓度为5.4±0.6ng/ml,非癌对照组为2.3±0.4ng/ml,两组之间具有显著的统计学差异(P=0.0002)。根据病理分型,磷癌、腺癌、小细胞肺癌BALF中8-OHdG表达水平均较非癌对照组高,且BALF中8-OHdG表达水平与TNM分期密切相关。此外,肺癌和非癌对照组BALF中8-OHdG浓度在吸烟者中分别较不吸烟者增高,并与吸烟指数呈正相关。IHC结果进一步验证了BALF中的研究发现。当BALF中8-OHdG表达水平为2.86ng/ml时,对肺癌诊断的敏感性和特异性分别为70.0%和73.7%。结论：吸烟与肺组织的氧化应激DNA损伤反应密切相关,8-OHdG可能是肺癌潜在的生物标志物。