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研究背景结肠癌是常见的消化道恶性肿瘤,发病率位列世界第三。近年来,随着社会人口老龄化的加剧,结肠癌的发病率呈现逐年增加的趋势。远处转移尤其是肝转移是导致结肠癌患者死亡的重要原因。导致结肠癌发生发展的因素很多,包括基因突变、遗传因素、肥胖和饮食习惯等。结肠癌的治疗方法目前仍以手术、辅助化疗和放疗等为主,但是这些治疗方法对中晚期结肠癌患者均没有很好的疗效。为了提高结肠癌患者的生存和生活质量、寻找有效的治疗靶点,因此,进一步研究结肠癌的发病机制具有非常重要的意义。烯醇化酶1 (Alpha-enolase, ENO1)是糖酵解过程中催化可逆反应2-磷酸甘油酸脱水形成烯醇式丙酮酸的关键酶。除此之外,ENO1还参与体内很多其他重要的生理过程,如低氧耐受、炎症反应和免疫调节等。目前研究表明,ENO1与肿瘤关系密切。ENO1在胰腺癌、肺癌、胆管癌、头颈癌等多种肿瘤中表达异常,且其表达水平与肿瘤的不良预后密切相关。ENO1还可以作为肺癌、乳腺癌和胃癌等早期诊断的生物标志物,在肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭和上皮间质转化中发挥非常重要的作用。但是ENO1在结肠癌中的作用研究很少,其作用及其作用机制还有待进一步研究。本研究首先在结肠癌组织及癌旁组织标本中确定ENO1表达的差异性,然后在细胞水平确定ENO1对结肠癌细胞增殖、迁移、侵袭及成瘤、转移能力等的影响。最后在分子水平上发现ENO1可以通过调控AMPK/mTOR信号通路发挥对结肠癌发生发展的调控作用。我们的研究结果可能为结肠癌的治疗提供新的靶点和理论基础。研究目的探究ENO1在结肠癌发生和转移中的作用,并通过ENO1所影响的信号通路进一步阐明ENO1的作用机理。研究方法1.在临床结肠癌组织标本及癌旁组织标本中检测ENO1的表达变化1)提取临床结肠癌及癌旁组织标本中的RNA和蛋白质,qRT-PCR和Western blot检测上述组织中ENO1 mRNA和蛋白质的表达。2)免疫组化方法检测上述组织中ENO1的表达。2.探究ENO1对结肠癌细胞增殖和迁移的影响1)采用逆转录病毒感染和慢病毒感染的方法分别建立ENO1高表达细胞系(HCT116-ENO1)、沉默细胞系(HCT116-shENO1-1和HCT116-shENO1-2)及它们相应的对照组细胞系,Western blot检测ENO1基因的蛋白质表达。2)通过MTT、流式细胞术、克隆形成、soft agar、细胞划痕、Transwell、 Matrigel等方法分别检测过表达和干扰ENO1对细胞周期、增殖、迁移和侵袭能力的影响。3)通过裸鼠皮下种植、尾静脉注射方式建立异种移植瘤和肿瘤远处转移模型,检测过表达和干扰ENO1对细胞成瘤能力及转移能力的影响。3.探究ENO1影响结肠癌发生和转移的作用机理1)应用ATP检测试剂盒,分别检测ENO1过表达和沉默细胞系中的ATP水平。2)应用Western blot检测ENO1不同表达状态下AMPKa/p-AMPKa、 ACC2/p-ACC2、mTOR/p-mTOR、s6rp/p-s6rp蛋白水平的变化,确定ENO1对AMPK/mTOR信号通路的影响。3)分别应用AMPK通路激活剂AICAR和mTOR通路抑制剂Rapamycin处理ENO1高表达及对照组细胞系,应用MTT、Transwell、Matrigel等检测细胞增殖、迁移和侵袭能力的改变,确定AMPK/mTOR信号通路介导ENO1的功能。4)在裸鼠异种移植瘤模型中分别给药AICAR和Rapamycin,观察成瘤能力的改变,在体内确定ENO1通过AMPK/mTOR信号通路发挥作用。研究结果1.与癌旁组织相比,ENO1在结肠癌组织中表达明显升高1)qRT-PCR和Western blot结果显示：结肠癌组织中ENO1 mRNA和蛋白质的水平明显高于癌旁组织。2)免疫组化结果显示：癌组织比癌旁组织中的ENO1蛋白质表达水平显著增高。2.ENO1促进结肠癌细胞系HCT116细胞的恶性转化1)过表达ENO1促进HCT116细胞的增殖、迁移和侵袭能力；而沉默ENO1基因表达后显著抑制HCT116细胞的增殖、迁移和侵袭能力。2)裸鼠异种移植瘤和转移模型实验显示：过表达ENO1基因显著增强HCT116细胞系的成瘤及转移能力,而干扰ENO1基因表达HCT116细胞的成瘤能力显著减弱。3.ENO1通过调控AMPK/mTOR信号通路发挥在结肠癌中的作用1)过表达ENO1促进HCT116细胞内ATP合成,而干扰ENO1抑制HCT116细胞内的ATP合成。2)过表达ENO1抑制AMPKa磷酸化,进而激活mTOR信号通路从而促进结肠癌细胞增殖、迁移和侵袭；而AMPK激活剂AICAR和mTOR信号通路抑制剂Rapamycin可以逆转过表达ENO1所引起的细胞效应。3)裸鼠成瘤实验表明在体内激活AMPK通路或抑制mTOR通路可以逆转ENO1过表达诱导的结肠癌细胞成瘤能力的增加。研究结论和意义本研究在临床组织标本、分子、细胞和动物水平,确定了ENO1促进结肠癌细胞增殖、迁移和侵袭的功能,研究结果揭示了ENO1促进结肠癌发生和发展的功能和分子机制。本篇研究首次证明了在结肠癌中,ENO1通过抑制AMPK信号通路来激活mTOR信号通路进而促进结肠癌细胞的肿瘤特性。对ENO1在结肠癌中的功能及分子机制的研究,可能为结肠癌的治疗提供新的靶点和理论基础。