姜科植物阳春砂(Amomum villosum Lour.)的干燥成熟果实是中药材砂仁的来源之一,因其种子团中的挥发油成分具有良好的止泻、镇痛、解痉等药理作用,被广泛应用于胃肠道疾病的中医临床治疗中。作为一味名贵的中药材,阳春砂价值高、市场需求量大,但由于在幼果发育阶段存在严重的落果现象,阳春砂的单位面积产量长期处于极低的水平。应用有效的保果方法以降低落果率是提高阳春砂产量的可行途径,而获得保果方法的前提是要研究调控阳春砂果实脱落的内在因素。本课题组前期进行了阳春砂果实发育和落果规律的研究,根据研究结果,本文采集人工授粉后第6、9、12、17、19、21、24天的正常果果柄离区(ZC),以及第16、17、19天的脱落果果柄离区(TL)为材料进行转录组测序。利用生物信息学方法,在表达谱中挖掘八种植物激素(生长素、乙烯、脱落酸、茉莉酸、细胞分裂素、水杨酸、油菜素甾醇)的生物合成和信号转导相关基因、植物细胞壁或细胞骨架合成及重构相关基因、钙结合蛋白基因以及转录因子;将这些基因和转录因子的表达量进行比较,分析它们在各正常果离区比较组(ZC vs ZC)、各落果离区比较组(TL vs TL)以及相同时期的正常果离区与落果离区比较组(ZC vs TL)中的表达趋势及表达差异情况;以期在转录水平上阐明离区中调控阳春砂果实脱落的分子基础。实验结果如下:(1)获得了数据量充足、质量可靠的转录组信息。转录组测序共得到 10.67 Gb Raw Reads、10.46 Gb Clean Reads,Q20 为 98.14%,Q30为93.41%。高通量数据经de novo组装后得到89,993个非冗余的Unigene,总长度为 115,706,046 nt,平均长度为 1285 bp,N50 为 2086 bp。将 Unigene比对到 NR、NT、Swissprot、KEGG、KOG、Pfam和GO等功能基因数据库中,被注释到任意数据库的Unigene有63,713个,总体注释率为70.80%。(2)分析了八种植物激素的生物合成及信号转导相关基因在不同时期的正常果离区和落果离区中的表达趋势以及表达差异。生长素合成相关基因amiE在正常果离区和落果离区中都随着时间推移持续下调表达;YUCCA的表达量在ZC6中表达量最高,随后下降,在ZC17和ZC19处升高后再次下降,而在落果离区中YUCCA表达变化不明显;在ZC vs ZC比较组中,ALDH(CL5948.Contig3)在ZC12处有表达高峰,其后下调表达,在落果离区中,ALDH先下调后上调;有3个ISS1/VAS1在ZC17处达到表达量高峰,其后下调表达,在各阶段的落果离区中,ISS1/VAS1的表达持续下降(Unigene38827),或呈现先升高后降低的趋势(CL458.Contig2,CL458.Contig3)。相比于同时期的正常果离区,在落果离区中amiE和YUCCA显著下调表达,ALDH和ISS1/VAS1显著上调表达。生长素信号转导相关基因AUX1在ZC12处有表达量的高峰,并且在ZC9或ZC19处明显下调;TIR1和ARF在正常果离区中总体上随着时间推移持续下调表达;在正常果离区中,A UX/IAA从ZC6至ZC12表达量持续下降,随后上调表达,表达量在ZC6或ZC24处达到最大。GH3在正常果离区中表达量较低,趋势不明显;SAUR在正常果离区中随着时间推移而上调表达;ILL在正常果离区中表达变化平缓,在ZC12或ZC19处明显上调;PIN1在ZC9处上调表达,PIN3则在ZC9处下调表达;上述基因在各时期落果离区内的变化不大。相比于同时期的正常果离区,在落果离区中GH3,SAUR32,ILL6显著上调表达,AUX1、TIR1、AUX/IAA(IAA1,IAA4,IAA9,IAA10,IAA17,IAA21,IAA26,I4A30)、ARF、SAUR66、ILL1及PIN显著下调表达。乙烯生物合成关键酶基因ACO和ACS的表达量在正常果离区中变化不明显,在落果离区中,ACO先上调后下调;相比于同时期的正常果离区,在落果离区中ACO和ACS均大幅度显著上调表达。在正常果离区中,乙烯信号转导相关基因ETR2随时间略下调表达;SIMKK在ZC12处出现表达量的高峰,随后下调表达;EIN2表达变化波动,在ZC12和ZC21处明显上调;EBF大致呈持续下调的表达趋势;在落果离区中,上述基因的表达量在TL17中上调或者下调表达,而在TL16和TL19中差异不大。相比于同时期的正常果离区,在落果离区中ETR2、ERF显著上调表达,SIMMK、EIN2、EBF显著下调表达。脱落酸生物合成或代谢相关基因NCED和CYP707A在正常果离区中大致呈下调的趋势,AOX和ABA2则相反;在落果离区中,NCED和CYP707A大致呈下调趋势,AOX和ABA2则是先上调后下调表达。相比于同时期的正常果离区,在落果离区中NCED(Unigene26445)和ABA2显著上调表达,CYP707A显著下调表达。脱落酸信号转导相关基因PYR/PYL(CL3012.Contig3,Unigene11974)在正常果离区中表达变化幅度较大,其在ZC9处达到表达量高峰,随后迅速下调表达;PP2C在正常果离区中大致呈下调趋势;SnRK和ABF的变化趋势较为平缓;在落果离区中,上述基因在ZC17处上调或下调表达。相比于同时期的正常果离区,在落果离区中PYR/PYL(PYL8,PYL4)、PP2C30、PP2C51、PP2C53、PP2C49、PP2C68、SnRK(SPAK1)显著上调表达,ABF(ABI5)显著下调表达。在正常果离区中,赤霉素生物合成相关基因KAO表达变化不明显;GA20ox则是持续下调表达;GA13ox和GA2ox都在ZC12处达到表达量的最大值,随后下调;在落果离区中,KAO先上调后下调表达,GA13ox、GA20ox及GA2ox的表达量变化平缓。相比于同时期的正常果离区,在落果离区中KAO和GA2ox显著上调表达,GA13ox和GA20ox显著下调表达。赤霉素信号转导相关基因DELLA、PIF3和PIF4在正常果离区中大致呈下调趋势;GID1则是先上调后下调表达。在落果离区中,上述基因在各时期之间的变化不大。相比于同时期的正常果离区,在落果离区中DELLA(SLR1,SLN1)、PIF3和PIF4显著下调表达。茉莉酸生物合成相关基因在正常果离区中的表达趋势各异,LOX(CL5556.Contig2)大致呈下调趋势;AOS变化平缓;AOC(CL11085.Contig2)的表达量波动变化,在ZC17和ZC24处明显上调。在各时期落果离区中,LOX变化趋势平缓;AOS(Unigene2857)持续下调表达;AOC持续下调表达(CL5435.Contig3)或先上调后下调(CL11085.Contig2)。相比于同时期的正常果离区,在落果离区中AOS显著上调表达,LOX显著下调表达。在不同时期的正常果离区中,茉莉酸信号转导相关基因JAR1和MYC2在ZC9或ZC12处明显上调表达,随后下调;JAZ的表达量在ZC9处最小,在ZC6或ZC17处最大。在各时期的落果离区中,TL17是三者表达量变化的拐点。相比于同时期的正常果离区,JAR1在TL17中显著下调表达,MYC2在TL19中显著上调表达。细胞分裂素生物合成或代谢相关基因LOG和CKX在正常果离区中的表达趋势相似,它们在ZC12中明显上调,随后下调表达。在落果离区中,LOG和CKX5先上调后下调;CKX6则是先下调后上调。相比于同时期的正常果离区,CKX6和LOG在落果离区中显著上调表达。在正常果离区中,参与细胞分裂素信号转导的HK3和HK5表达量变化趋势相似,它们在ZC9或ZC12处上调表达,在ZC17下调表达;HK4的表达趋势与前两者相反,其先在ZC9处下调,随后持续上调表达。在落果离区中HK4表达量较低,趋势不明显,HK3和HK5则是先下调后上调表达。相比于同时期的正常果离区,在落果离区中HK5显著上调表达,HK4显著下调表达。水杨酸信号转导相关基因NPR和TGA的在正常果离区中的表达量的峰值都出现在ZC12处;在落果离区中,NPR1和TGA1持续上调表达;NPR5持续下调表达;NPR2,TGA2.2及TGA4先下调后上调。在正常果离区中的表达极低PR-1却在TL17处达到表达量的峰值。相比于同时期的正常果离区,在落果离区中NPR1、TGA1和PR-1均显著上调表达。油菜素内酯合成相关基因DET2和DWF4在正常果离区中大致呈下调趋势,而CPD在ZC12处明显上调表达;在各时期的落果离区中,DET2和DWF4先下调后上调,CPD则是持续上调表达。相比于同时期的正常果离区,在落果离区中DWF4和CPD显著上调表达,DET2显著下调表达。参与油菜素甾醇信号转导的基因中,BRI1,BIN2,BKI1和BZR1在正常果离区中的表达量变化较为平稳,它们在ZC12处有明显的上调表达;BSK1大致呈下调趋势(CL904.Contig4)或先上调后下调(CL9938.Contig1);CDL1在ZC12处下调后又在ZC17或ZC19处上调表达;在各时期落果离区中,CDL1,BIN2和BZR1的表达量变化平稳;BRI1总体呈先下调后上调趋势;BKI1持续下调;BSK1总体呈上调趋势;相比于同时期的正常果离区,在落果离区中BRI1(Unigene32328),BKI1,BIN2(Unigene4593)和 BZR1(CL8264.Contig3,CL9802.Contig2)显著上调表达,BRI1(CL2479.Contig1,CL2479.Contig4),CDL1,BIN2(CL469.Contig3,CL5344.Contig2,CL5575.Contig1)和BZR1(Unigene29418)显著下调表达。(3)分析了参与细胞壁或细胞骨架合成与重构、钙信号转导的蛋白基因在落果过程中的表达差异。除编码β-1,3-葡聚糖酶、几丁质酶、β-葡萄糖苷酶、糖基转移酶IRX15、岩藻糖基转移酶和部分的多聚半乳糖醛酸酶的基因外,大部分参与细胞壁和细胞骨架合成或重构蛋白的基因在落果离区中显著下调表达:如内切葡聚糖酶基因EG10、EG24;果胶甲酯酶或果胶甲酯酶抑制因子基因PME-like、PME31、PPE8B-like、PPE12、PPE16、PPE34、PPE51;扩张蛋白基因EXP-A2、EXP-A4、EXP-A6、EXP-A7、EXP-Al0、EXP-A15、EXP-B16、EXP-B18;半乳糖基转移酶基因 GAUT、GAUT-like1、GA UT-like2、GAUTlike-3、GAUT4、GAUT7、GA UT8-like、GAUT12、GA UT13、GAUT15;纤维素合成酶基因CESA1、CESA5、CESA-like E6、CESA9;COBRA 蛋白基因COBRA-like1、COBRA-like4;木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶基因XTH5、XTH7、XTH8、XTH9、XTH28、XTH31-like、XTH32;β-半乳糖苷酶基因βGal2、βGal3、βGal5、βGal-like;木葡聚糖木糖基转移酶基因XXT1;糖基转移酶基因IRX9;1,4-β-甘露聚糖内切酶基因MAN2-like;UDP-阿拉伯吡喃葡萄糖突变酶基因UMA1;Formin类蛋白基因Formin-like1、Formin-like8。相比于正常果离区,钙或钙调素结合蛋白CaM(CL9295.Contig1)、CML14、CML18的表达量在落果离区中显著上调,而CaM(CL10915.Contig2)、CML27、CML7、CBL、CRK、CNX的表达量在落果离区中显著下调。(4)筛选了在落果离区中显著差异表达的转录因子。共筛选得到268个在正常果和落果离区比较组(ZC vs TL)中显著表达超过8倍的转录因子。发现含有 ABI3/VP1,ARF、bZIP、C2C2-GATA、GRAS、GRF、HB、LIM、MADS、mTERF、RWP-RK、TAZ、TCP、Tify 及 zf-HD 结构域的 TFs 在落果离区中下调表达,而属于Alfin-like和SRS家族的TFs在落果离区中上调表达。在共有差异表达的TFs中,多数的NAC和WRKY家族TFs在落果离区中上调表达;而属于 AP2-EREBP,bHLH,C2C2-Dof,C3H,MYB 及 SBP 家族的 TFs 则大多在落果离区中下调表达。上述转录因子的功能与激素和胁迫的响应以及衰老调控有关。基于以上分析结果,结合各基因的功能和文献资料,推测IAA、GA、CTK等生长促进类激素的含量在正常果离区水平较高,保证了细胞的正常生长和发育;而在落果离区中,ETH被大量合成,加快了组织细胞的衰老和凋亡,并且细胞壁和细胞骨架合成与重构相关基因的下调使得细胞壁黏度下降、延展受阻、组织脆性增加最终导致脱落;器官脱落后编码病程相关蛋白几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶的基因上调表达可能与保护层的形成有关。ABA、SA、BRs的生物合成或信号转导活动在落果时被增强,推测它们协同ETH促进脱落,或者提高植物抗性以应对脱落后可能发生的病原体侵染。Ca2+信号转导在落果离区中不活跃;转录因子可能主要通过协同激素的合成或信号转导、促进胁迫反应、调节局部组织的成熟或衰老来介导落果进程。本研究首次将转录组测序方法应用于阳春砂落果研究,筛选得到了大量的可能与果实脱落相关的、具有进一步研究价值的基因,为阳春砂落果机理的深入研究打下了坚实基础。