目的:肿瘤组织内血管生成对肿瘤组织的生长浸润和转移起到至关重要的作用,而间充质干细胞归巢至肿瘤组织,成为肿瘤微环境的组成成分,可参与肿瘤血管拟态生成,促进肿瘤血管形成并影响肿瘤的发生发展。目前多数实验方法都只能对其中的单一因素对肿瘤血管拟态生成影响进行研究,本次实验借助微流控芯片技术平台,建立了复杂的脑胶质瘤血管拟态发生模型,将三维共培养的肿瘤细胞、细胞外基质、内皮细胞或间充质干细胞和缺氧环境等多因素统一于一个实验体系中,充分模拟体内环境,探讨各因素相互影响下的肿瘤血管拟态生成机制。方法:芯片的设计与制作由大连化学物理研究所采用软蚀刻方法制作而成。以聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane,PDMS)作为芯片制作材料。芯片通过等离子处理将两层PDMS(通道面以及养细胞的底面)进行不可逆封接。用小鼠骨髓间充质干细胞MSC细胞系为间充质干细胞,提取人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC,简称EC)作为血管内皮细胞,人脑星形胶质瘤细胞系U87细胞为脑肿瘤细胞,人脑星形胶质瘤细胞系U87细胞转染缺氧诱导因子Hif-2α为肿瘤内部缺氧环境下的脑胶质瘤细胞,利用基底膜基质(Matrigel)作为细胞外基质细胞基质在缺氧装置中培养,从而建立了多因素三维体外模拟肿瘤微环境内血管拟态生成模型。由于基质两侧通道内的两种细胞分泌不同的生长因子,可观察在两种细胞相互影响下向三维基质内生长的细胞形态变化、迁移情况。通过改变培养环境内氧气含量,可观察缺氧条件下不同细胞的生物学行为变化。用Image-pro Plus6.0对采集图像进行分析,对U87和MSC细胞在三维基质内的相互迁移距离和数量进行统计分析,并分别分析不同氧浓度条件下的两种细胞成血管网络样生长面积进行统计。对活细胞染色内皮细胞在缺氧和常氧情况下凋亡进行统计分析。采用免疫荧光染色的方法分析MSC的向内皮分化特异性抗体CD31表达情况。结果:1.体外模拟脑肿瘤微环境芯片的制备迁移芯片有5个通道,通道之间相互连通,其中有三条主通道为细胞培养通道,每条通道高150~160μm,宽500μm,三条主通道间隔两条胶原侧通道,每条通道高70~80μm,宽200μm,主通道与胶原通道间为两排微柱结构,进入胶原通道内的Matrigel胶原依靠液体张力维持在微柱周围形成细支通道,与胶原侧通道共同形成完整的胶原通道。细支胶原通道高为70~80μm,宽80μm。通过胶原通道内胶原形成的基质屏障,使每条细胞通道区域都可单独实现其功能,又可使主通道间可以通过胶原进行液体和细胞外因子的相互自由交换,可以建立两种细胞的非接触式共培养体系。2.微环境芯片上细胞实验结果(1)在缺氧及常氧条件下,对比U87-MSC与U87-EC分别共培养的实验结果显示,缺氧环境中U87细胞在两组共培养体系中向MSC和EC迁移和成网络生长能力显著提高(P<0.01);(2)对比缺氧条件U87-EC与常氧条件U87-MSC两组共培养的U87迁移及成网络生长的能力,统计结果无差异;实验结果还表明,在缺氧和U87-MSC共培养条件下,U87细胞迁移及成网络生长能力最显著(P<0.001)。在U87-EC共培养体系内,缺氧和常氧状态下EC均没有发生迁移,并且缺氧条件下EC细胞凋亡数目显著增加(P<0.05)。对比U87hif2α-MSC与U87-MSC分别共培养,U87hif2α-MSC共培养组的MSC迁移和成网络生长能力显著增强(P<0.01)。缺氧及常氧条件下,U87-MSC共培养与MSC单独培养,共培养组缺氧及常氧条件下MSC内皮特异性抗体CD31免疫荧光染色结果呈阳性,且荧光强度缺氧组更强(P<0.01),而单独培养的MSC在两种条件下CD31免疫荧光染色结果均成阴性。结论:本研究以微流控芯片技术为实验平台,体外模拟脑肿瘤微环境,并利用间充质干细胞MSC、脐静脉内皮细胞HUVEC、U87脑胶质瘤细胞、Matrigel胶原作为细胞外基质,结合缺氧条件,构建出了体外三维的细胞、基质、缺氧等多因素结合的体外肿瘤微环境模型。利用该模型我们了建立了肿瘤血管拟态的生成模型,从而研究肿瘤新生血管过程中,肿瘤细胞、内皮细胞及间充质干细胞的作用及相关机制,进一步证明肿瘤细胞可促进间充质干细胞归巢,并参与肿瘤血管拟态生成从而促进肿瘤血管新生,起到促进肿瘤的发生发展的作用。