目的：血管新生是恶性肿瘤细胞生长、增殖、侵袭不可缺少的重要条件之一。血管内皮生长因子(VEGF)是重要的促血管新生调节因子，VEGF水平的高低已经成为一些实体瘤的独立的预后因素。VEGF主要通过与细胞表面受体Flt-1和KDR结合而发挥其生物学功能。已经证明，Flt-1在血管重塑过程起着重要作用，而KDR可促进内皮细胞增殖、迁移，促使血管新生，且VEGF及KDR在多种实体瘤细胞中高表达。阻断KDR与VEGF的作用，可抑制肿瘤生长与浸润。 新近，越来越多的证据表明，急性白血病患者骨髓微血管密度明显增高，与VEGF高表达密切相关。随后的研究发现，VEGF在多种白血病细胞系呈高表达。过去认为KDR特异表达于增殖的血管内皮细胞，现在发现其在造血干细胞及一些白血病细胞系中也表达。白血病是来源于造血干细胞分化成熟不同阶段的一类恶性增殖性疾病。由此，我们认为VEGF及受体KDR可能在白血病的发生发展过程中起着重要的作用。故本实验对VEGF及受体KDR在白血病细胞中的表达及其生物学意义进行研究，旨在获得一种新的治疗白血病的方法。 方法：1．运用酶联免疫吸附测定法，定量检测88例急性白血病患者(其中25例伴髓外浸润)及30例正常人血清中及白血病细胞上清液中VEGF的含量。 2．取45例初发急性白血病患者(其中30例伴髓外浸润)及20例正常人的骨髓标本，分离单个核细胞，采用免疫细胞化学、RT-PCR、Western blot方法对急性白血病患者、正常人的骨髓单个核细胞及HL-60白血病细胞系中VEGF及受体KDR的mRNA及蛋白表达情况进行检测，试图证明VEGF及受体KDR在白血病细胞中呈高表达。中南大学 博士学位论文 3．选取所测KDR阳性的白血病细胞，采用细胞体外侵袭实验，用加有 VEGF和无 VEGF的培基中孵育 18h，比较 VEGF刺激时和无VEGF刺激时，KDR阳性的白血病细胞体外侵袭力的强弱。 4．对KDR阳性的白血病患者单个核细胞、HL60细胞及正常人的单个核细胞在VEGF和无VEGF的培基中孵育，分离上清。采用明胶酶谱法，比较二者上清液中明胶酶一A（MMP2）活性的差别。结果：1．初发急性白血病及复发患者化疗前血清及细胞上清液中VEGF水平明显高于正常人Od．01）；血清VEGF含量与外周血幼稚细胞数及骨髓中原始细胞数呈显著正相关行一0．499，0石69，均 Pd．01）；且髓外浸润组血清VEGF水平明显高于无浸润组血清VEGF水平 （P＜0刀5）。 2．免疫细胞化学法检测VEGF蛋白在45例AL中阳性表达率为73．3％，其中33例AML患者中，25例VEGF蛋白表达阳性，表达率为75．8％；12例ALL中，8例表达阳性，表达率为66．7％。30例髓外浸润组中，26例VEGF蛋白表达阳性，表达率为86．7％，15例无髓外浸润组中，7例表达阳性，表达率为46．7％。各组与正常组比较差异有显著性①a．05人 髓外浸润组与无髓外浸润组比较差异有显著性0＜队05人 ＊L60细胞呈阳性表达。 3．RTPCR法检测 VEGF及 KDR基因在 45伊 AL患者中的表达率为82．2％、60％。其中AML患者中VEGF及KDRmRNA阳性表达率为84．8％、60．7％。ALL患者中，VEGF及KDRmRNA的阳性表达率为75％、58．3％。各组与正常组比较差异有显著性0d．05人另夕，髓外浸润组 VEGF及 KDRmRM的阳性表达率为 93．3％、73．3％均明显高于无髓外浸润组60％、33．3呵P＜队05、 4．Western七lot法检测VEGF及KDR蛋白在白血病细胞中的表达，发现VEGF蛋白的阳性表达率为64％明显高于正常组10％0＜0．05人KD R蛋白的阳性表达率为51．3％明显高于正常组无表达。同时，我们对髓外浸润组及无髓外浸润组VEGF及KDR蛋白进行半定量检测，结果显示：髓外浸润组VEGF及KDR蛋白的含量明显高于无髓外浸润组O奶．05人 IV中南大学 博士学位 文 5．细胞体外侵袭实验结果显示，VEGF孵育的KDR阳性白血病细胞穿膜率为门7．9士0．4）％，无VEGF孵育的KDR阳性白血病细胞穿膜率为抢士 0．3）地两者差异具有显著意义o们．05人 6．明胶酶谱法结果表明：正常人MNC无MMP毛的表达，而KDR阳性的白血病细胞在无VEGF的条件下，可表达MMPz。VEGF刺激时，MMP2活性增强明显高于无VEGF刺激时的MMP工的活性（P＜O．05）。 结论：1．血清VEGF水平可以作为白血病诊断、监测复发及化疗疗效判定的有用指标；一定程度上可能反映白血病细胞总负荷。并在白血病的髓外浸润中起着重要作用。 2．VEGF及KDR在白血病细胞中呈高表达，与白血病的发生和髓外浸润有着密切的关系，可作为判定白血病发生及髓外浸润的指标。 3．VEGF在白血病中可能的作用有，其可通过旁分泌的形式促进内皮细胞增生，进而血管新生；还可以自分泌的形式促进白血病细胞增殖、迁移。 4．VEGF与受体KDR结合可上调白血病细胞分泌MMPE，促进白血病细胞迁移，增强了白血病细胞侵袭的能力，诱发髓外浸润。