中枢神经系统真菌感染的治疗非常具有挑战性,其死亡率居高不下。在所有的中枢神经系统真菌感染中,隐球菌脑膜脑炎所占比例最高。随着免疫抑制疗法治疗自身免疫性疾病和获得性免疫缺陷综合征(HIV/AIDS)越来越多的应用,隐球菌病的发病率正逐年攀升。据估算,每年有100万新发的隐球菌脑膜脑炎患者,并有62.5万人因此而死亡。隐球菌病最初多由于肺部吸入隐球菌孢子导致的肺部感染和肺炎,在缺乏有效的免疫反应时,真菌孢子可以播散通过血脑屏障(BBB),导致脑膜脑炎,引起诸如发热、头痛、视力障碍、精神改变的症状。肺部感染是隐球菌入侵人体的第一步,而肺部固有吞噬细胞如肺泡巨噬细胞、树突状细胞是肺部免疫系统的先锋哨兵,最先与入侵病原体开始斗争。巨噬细胞与隐球菌的相互作用可以直接影响隐球菌病的临床转归。而巨噬细胞的极化状态可以决定其抗真菌功能,其中M1型极化状态可以起到杀真菌的作用,而M2型极化则保护真菌,为真菌的生存、繁殖、免疫逃逸、穿越血脑屏障提供便利。本研究重点关注阿奇霉素干预下的肺泡巨噬细胞与隐球菌的相互作用。阿奇霉素是一种针对社区获得性细菌、支原体感染的大环内酯类抗生素,同时阿奇霉素具有免疫调节作用,可以起到抑制炎症、促使巨噬细胞向M2型方向极化的作用。早期、难诊断的隐球菌肺炎常常因为被误诊为社区获得性肺炎(CAP)而系统使用阿奇霉素治疗。尽管有体外药敏试验证明,阿奇霉素可以和两性霉素B产生协同的抗隐球菌作用,但是我们的数据证实,阿奇霉素削弱了宿主免疫系统的抗真菌能力,促进了隐球菌的体内播散,增加了感染隐球菌小鼠肺部的菌核量。本研究也揭示了体外药敏试验不能完全反映宿主-病原体相互作用的真实过程。考虑到新生隐球菌是一种兼性胞内寄生菌,它与巨噬细胞相互作用的结果可以直接决定宿主隐球菌感染的临床结局,因此我们猜测阿奇霉素对巨噬细胞的抗真菌能力产生了削弱作用。有研究证明阿奇霉素可以促使巨噬细胞转向M2型极化,而巨噬细胞的极化状态与其代谢重编程关系密切。本项研究中,我们报道了阿奇霉素通过上调GPT2的表达改变巨噬细胞的谷氨酰胺代谢,进而促使肺泡巨噬细胞向M2型方向极化并削弱巨噬细胞杀真菌能力,最终导致隐球菌感染的播散和恶化。具体来说,本研究采用平行样本进行高通量代谢组-转录组联合分析来揭示阿奇霉素处理的巨噬细胞系全部的系统性变化,揭开了阿奇霉素处理的巨噬细胞引起的差异代谢模块的全部信息,确定了阿奇霉素处理引起的差异功能代谢模块和特定的差异表达基因。通过去除培养基中的谷氨酰胺和敲减GPT2基因,阿奇霉素和IL-4处理的巨噬细胞显示出M2型极化的缺陷。根据q PCR检测得到的ARG1/i NOS这一比值,这一结果也可以理解为GPT2敲减的巨噬细胞对谷氨酰胺的缺乏较野生型细胞系更具有抗性,这也更加验证了谷氨酰胺代谢模块在IL-4和阿奇霉素诱导的M2极化中起到重要作用。此外,本研究也展示了GPT2基因上调在M2极化的中扮演着十分重要的作用。GPT2(谷氨酰胺丙酮酸转氨酶)是一种转氨酶,它可以催化谷氨酸盐为α-酮戊二酸(α-KG)。有文献报道,在肿瘤细胞中,高表达的GPT2会产生更多的α-KG以补充到三羧酸循环中产生更多的ATP以维持肿瘤的快速增殖。靶向代谢组也证实阿奇霉素处理的巨噬细胞中的α-KG比对照组中高,这与我们的猜想一致。进一步研究证实,向无谷氨酰胺的培养基中加入4m Mα-KG可以一定程度上弥补巨噬细胞向M2型极化的能力。总结起来,这些数据有力的证明了阿奇霉素通过上调GPT2产生更多的α-KG来驱动巨噬细胞向M2方向极化。我们进一步通过小鼠隐球菌吸入感染的自然病程模型中,证实了在感染第7天起,GPT2转录水平明显升高,这说明GPT2在隐球菌感染早期就有激活,或可以作为隐球菌病的早期诊断生物标记物。我们进一步通过收集12名隐球菌病病人和12名健康人的外周血单个核细胞(PBMCs),通过荧光定量PCR检测确定病人的GPT2转录水平明显高于健康人。进一步验证了我们的推断,GPT2可以作为隐球菌病早期诊断的生物标记物。概括起来,本研究揭示了阿奇霉素通过上调GPT2促进谷氨酰胺分解代谢来驱使巨噬细胞向M2型方向极化,并使之对谷氨酰胺缺乏更敏感。研究证实阿奇霉素可以上调ATF4,进一步激活GPT2的表达,通过重编程细胞的谷氨酰胺代谢促使巨噬细胞向M2方向极化,胞内α-KG的升高导致α-KG/Succinate比值的升高。以上结果表明ATF4-GPT2-α-KG/Succinate轴是隐球菌病潜在的可以调节免疫反应的治疗靶点,这也可以帮助我们更深入的认识对真菌感染免疫缺陷的机制。本研究尚具有重要的临床意义。首先,对于病原体未知的CAP,不应首先系统使用阿奇霉素治疗;其次,GPT2可作为隐球菌病潜在的治疗靶点和早期诊断生物标记物,来确定有系统性真菌感染风险的人,做到早期预防。