头颈部由于具有特殊的解剖结构和生理特性，在治疗恶性肿瘤的临床实践中，对于发生在比邻重要解剖部位和具有早期转移特性的恶性肿瘤，手术及放化疗的效果都不理想，同时由于头颈部的特殊解剖结构，这些治疗往往造成患者的生存质量低下。随着分子生物学和肿瘤生物学的发展，导向药物成为近20年来治疗恶性肿瘤的重要方向。导向药物是利用某种对肿瘤细胞具有特异性结合能力的物质作为载体，将具有细胞毒性物质运输靶细胞，从而特异性杀肿瘤细胞而对其他正常细胞无毒性作用。这种载体—细胞毒性物质复合体就被称为导向药物。根据不同的构建方式，也被称为重组毒素或免疫毒素。作为导向药物的载体主要有：单克隆抗体或基因工程抗体片段；各种细胞因子，细胞表面因子；小肽激素等。这些物质都具有与某些肿瘤细胞特异性结合的能力，并且结合效率高。同时还有结构简单，易于应用基因工程方法与其他毒素基因连接的特点。毒性部分一般是采用化学毒素，细菌毒素和放射性毒素。Ang可以由载体定向带入靶细胞内，发挥其核糖体灭活的活性，抑制细胞蛋白质的合成，杀死靶细胞。载体和毒性部分的结合有两种方法：一是用化学方法将载体蛋白和毒性蛋白利用共价键连接，另外就是将载体基因和毒性部分基因定向连接，在不同系统中表达出融合蛋白。就目前的研究结果来看，基因水平的连接产生的融合蛋白具有性质稳定，易于大量制备等特点。从上世纪80年代开始，已有多种导向重组毒素构建成功，如<WP=80>美国FDA已批准正式应用临床。本实验目的是利用恶性黑色素瘤细胞表面MSHR高表达的特性，应用基因重组技术将α-MSH与细胞毒性物质人血管生成素（Ang）重组，并将其构建在PET-20b的表达系统中，在大肠杆菌BL21（DE3）Plyss中表达出融合蛋白MSH- Ang。这种融合蛋白同时具有MSHR的结合能力和Ang具有的诱发血管生成活性及 RNA酶活性来降解RNA，从而杀死细胞。经过疏水作用层析，离子交换层析，亲和层析纯化后，得到较纯的目的蛋白。应用纯化的MSH- Ang进行体外细胞毒性实验，分别将MSH- Ang加入黑色素瘤B16细胞，喉癌Hep-2细胞，胃癌BCG-823细胞及宫颈癌Hela细胞光镜下观察对喉癌细胞的培养液中，同时用BL21（DE3）Plyss空菌的表达产物及中国仓鼠卵巢细胞（CHO）作为对照，12小时后观察对细胞形态和数量。结果：基因测序结果表明重组MSH- Ang构建序列正确，表达出的融合蛋白占总蛋白的10%。并已建立可靠的纯化路线，经纯化后纯度可达到92%。对黑色素瘤细胞B16，喉癌细胞Hep-2细胞形态改变，折光率下降，甚至死亡，具有明显细胞毒性作用。此外，对胃癌细胞BCG及宫颈癌Hela细胞也具有杀伤作用，对照组细胞没有明显变化 。结论：本研究发现应用α-MSH作为导向弹头的重组毒素不仅对已知的高表达MSHR的肿瘤具有特异性杀伤作用，还对如鳞癌，胃癌等肿瘤具有明显毒性，是一种对多种常见肿瘤细胞具有杀伤功能导向毒素， 这可能与这些肿瘤表面也具有MSHR或类似受体如ACTHR有关。本研究还建立了MSH- Ang0的高效表达系统，其表达效率达到国际先进水平，并基本建立了切实可行的蛋白纯化路线，可达到92%以上，为今后开发特异性杀伤头颈部常见肿瘤的基因工程药物奠定了基础。