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骨髓基质干细胞(BMSCs)作为成骨细胞的前体细胞,对于骨的形成和重建具有重要的意义,通过基因治疗的方法增加BMSCs的成骨潜能成为一个新的研究领域。Satb2是一种特殊富含AT序列结合蛋白家族的核基质蛋白,在BMSCs的分化和颌面部骨的修复重建过程中起重要的作用。作为一个在成骨分化和骨骼塑型中起重要作用的基因,Satb2对BMSCs定向、分化和增殖等行为的调控机制有待研究。本研究拟使用慢病毒转染建立稳定表达Satb2的BMSCs细胞株,通过体内体外实验观察Satb2对成骨分化的促进作用,通过niRNA表达谱分析观察miRNAs在Satb2介导的BMSCs成骨分化过程中的作用,对Satb2促进成骨分化的分子生物学机制进行进一步的研究,为基因治疗和干细胞技术在骨再生领域的广泛应用提供更直接的科学线索。材料和方法：第一部分使用PCR克隆小鼠Satb2基因,构建pTA2-Satb2质粒。将质粒pTA2-Satb2与慢病毒载体重组形成慢病毒载体LV-Satb2,建立稳定表达Satb2的BMSCs细胞株。分别于成骨诱导7d和14d进行碱性磷酸酶染色和茜素红染色。使用蛋白印迹和实时定量PCR检测成骨因子Rur2、Sp7、Atf4和Bsp的表达。将β-磷酸三钙支架和BMSCs在成骨诱导培养基中联合培养14d后,将共培养物植入小鼠股二头肌内侧。4周后将植入物取出进行组织学观察和实时定量PCR检测成骨因子表达。第二部分使用Affymetrix(?) GeneChip miRNA芯片检测Satb2过表达的BMSCs在成骨诱导7d时的miRNA表达情况,将差异变化≥1.5倍作为显著差异,并通过实时定量PCR进行验证。利用生物信息学工具从Sanger数据库中筛选出差异表达的miRNA并对靶基因进行预测,使用GO和KEGG通路分析的方法探讨基因和miRNA的相互作用。选择差异表达的miR-27进行功能性分析。首先通过慢病毒载体建立miR-27a过表达的BMSCs,为了验证miR-27a对成骨分化的作用,对转染后的BMSCs进行成骨诱导分化,分别于第7d和第14d进行碱性磷酸酶染色和茜素红染色检测miR-27a;对成骨分化的影响。使用蛋白印迹检测]miR-27a的靶基因(BMP2、BMPR1a和Smad9)的表达。第三部分为了进一步探讨Satb介导的成骨分化过程中miRNA和靶基因的调控作用,使用蛋白印迹和实时定量PCR检测Satb2过表达的BMSCs在成骨分化过程中Sp7和miR-27a的表达情况。使用蛋白印迹和实时定量PCR检测miR-27a过表达的BMSCs中Sp7的表达。使用实时定量PCR检测Satb2过表达的BMSCs成骨分化中相关成骨因子的表达情况。使用PCR扩增含miR-27a靶位点的Sp7编码区,构建靶基因psiCHECK-2-Sp7并测序鉴定。以构建的重组载体psiCHECK-2-Sp7为模板,利用定点突变试剂盒进行定点突变,并经酶切测序鉴定。分别与]miR-27a表达载体共转染293T细胞,通过荧光素酶活性反应验证Sp7是否为miR-27a的靶基因。结果：第一部分蛋白印迹和实时定量PCR检测发现Satb2过表达的BMSCs中Satb2均高表达,Runx2、Sp7、Atf4和Bsp等成骨相关基因的表达同样显著增加。成骨诱导分化7d和14d时,Satb2过表达组中碱性磷酸酶和茜素红染色均高于对照组。体内成骨实验发现Satb2过表达的BMSCs能够显著促进异位新骨的形成。第二部分miRNA表达谱检测发现28个miRNAs差异表达,经实时定量PCR验证4个miRNAs (miR-27a、miR-125a-5p、miR-146b和miR-466f-3p)下调和3个miRNAs (miR-17. miR-20a和miR-210)上调。GO分析显示这些miRNA的靶基因的主要功能为调控间充质干细胞分化、骨形成和骨骼发育以及BMP信号通路和TGF-β受体信号通路。KEGG通路分析显示TGF-β、MAPK、Wnt、hedgehog和VEGF通路参与了Satb2介导的BMSCs成骨分化。在miR-27a过表达的BMSCs细胞中,蛋白印迹显示BMP2、BMPR1A和Smad9在miR-27a转染后表达显著下降,提示BMP2、BMPR1A和Smad9可能是miR-27a的靶基因。miR-27a过表达的BMSCs在成骨分化中,碱性磷酸酶和茜素红染色较对照组均显著降低。第三部分在Satb2介导BMSCs成骨分化过程中,Sp7表达的上调趋势与miR-27a的下调趋势呈现时间依赖的负相关。在miR-27a过表达的BMSCs中,Sp7的蛋白水平和基因水平较对照组明显下降。miR-27a和Sp7共转染组的荧光素酶相对活性较空白对照组明显降低,而miR-27a和Sp7变异组则无明显变化,提示Sp7可能是miR-27a直接作用的靶基因。结论：1.通过慢病毒转染建立了稳定表达Satb2的BMSCs细胞株,体外细胞学研究发现Satb2促进BMSCs的成骨分化,体内实验证明Satb2过表达的BMSCs能够有效地促进异位新骨形成。2.通过miRNA基因芯片和生物信息学分析的方法,发现一系列差异表达的miRNA通过其靶基因正向或负向调控TGF-β/BMP信号通路,在Satb2介导的BMSCs成骨分化的早期阶段发挥着重要的调节作用。3.在Satb2介导的BMSCs成骨分化中,Sp7作为miR-27a的靶基因，与Satb2和miR-27a可能构成了一个反馈调节网络,对成骨分化起着调控作用。