目的:心房颤动（atrial fibrillation,AF）简称房颤,是临床中最常见的一种心律失常,可由多种疾病导致,包括冠状动脉粥样硬化性心脏病、心肌病、心力衰竭、糖尿病等。房颤发生的机制复杂,原因包括心房结构重构、电重构、自主神经系统调节功能障碍和钙离子调节稳态失衡等。其中心房结构重构是AF产生的关键因素,而心房纤维化则是心房结构重构最突出的特征。心房纤维化可分为反应性纤维化和修复性纤维化,反应性纤维化是心肌在受到炎症刺激或压力负荷时细胞外基质（extra-cellular matrix,ECM）蛋白在心肌纤维间异常沉积,围绕心肌细胞形成了胶原纤维而引起的电传导异常,在此过程中,心肌细胞相对保持完整,无心肌细胞的丢失以及纤维化瘢痕的形成,常见在术后房颤（postoperative atrial fibrillation,POAF）或早期阵发性房颤中。而修复性纤维化则是主要发生了心肌细胞的坏死和凋亡,大量纤维瘢痕组织取代了正常的心肌组织,造成了不可逆的损伤。心房纤维化是复杂的病理生理过程,包括成纤维细胞异常增殖和分化、ECM蛋白过度合成和不规则沉积、脂肪细胞浸润,以及炎症因子的趋化等。因此,对心房纤维化分子机制的研究,以及探索预防和治疗心房纤维化的方法对房颤的治疗具有十分重要的意义。二甲双胍（metformin,Met）具有强大的降糖作用,因其公认的安全性和相对较低的成本,成为了临床中治疗2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus,T2DM）应用的最广泛一线药物。在应用二甲双胍长期的临床治疗以及研究过程中,发现了二甲双胍除具有降糖作用外,还具有其他独立的多种重要功能,包括心血管保护、改善脂肪代谢、减轻炎症和氧化应激、减轻组织纤维化等。有研究证明,二甲双胍可降低T2DM患者发生AF的风险,该过程可能是通过独立的非降糖机制减轻了炎症反应、减轻了心肌反应性纤维化,从而降低了房颤的易感性,但该作用的具体的有效分子机制尚未完全阐明。整合素（integrin,ITG）是一类主要在上皮细胞分泌表达的蛋白家族,主要功能是控制细胞-细胞、细胞-ECM之间的信号交流,将细胞锚定在ECM上,控制细胞粘附和迁移,是调节细胞相关生理功能的关键因子。ITGβ6是整合素蛋白家族中的一员,是TGF-β1、TGF-β3的潜在激活剂,也可与TGF-β1形成环状反馈,相互影响。转化生长因子-β（transforming growth factor-β,TGF-β）广泛的存在于多种生物的各种细胞中,具备多种生物学功能,包括调节细胞生长、炎症、细胞基质合成和细胞凋亡等,被认为是与调节免疫与组织纤维化相关的关键细胞因子。有研究表明敲除或抑制ITGβ6基因可下调局部组织的TGF-β1表达,大幅度降低纤维化水平,在肾脏和肺中被认为是调节纤维化的主要因素。二甲双胍可通过抑制TGF-β1相关信号通路减轻炎症水平、减轻纤维化程度,但其上游信号分子ITGβ6对心房纤维化的影响以及二甲双胍对ITGβ6/TGF-β1信号通路的作用尚未完全了解,需进一步实验证实。本研究的目的是:（1）通过收集临床病例资料,回顾性分析二甲双胍对T2DM患者非体外循环冠状动脉旁路移植术（off-pump coronary artery bypass grafting,OPCABG）后早期POAF的保护性作用,并进一步探讨该保护性作用与二甲双胍降糖作用的关系;（2）通过动物实验观察研究二甲双胍对兔心房快速起搏（rapid atrial pacing,RAP）诱导心房纤维化模型的左房结构重构、电重构、脂肪与炎症浸润的影响;（3）通过动物实验观察研究二甲双胍能否够通过抑制ITGβ6/TGF-β1信号通路调节心房纤维化,减轻炎症浸润,降低心房颤动的易感性。以此阐明二甲双胍通过非降糖作用对心房纤维化的预防以及治疗的机制,为进一步研究心房颤动的预防以及治疗提供理论依据。研究方法:第一部分:采用队列研究,回顾性分析二甲双胍对患有T2DM的患者OPCABG术后早期POAF的影响。本研究选取了2019年1月—2019年12月在北部战区总医院心血管外科单纯行OPCABG且合并患有T2DM的患者,共339人（男性247人、女性92人）,以是否连续服用了二甲双胍作为分组标准,分为Met组（118人）和非Met组（221人）。对两组患者的术前基本信息、护理记录指标、糖尿病用药、围术期实验室指标、超声心动图和心电图等数据使用SPSS 25.0软件进行相关统计学计算分析。计量资料符合正态分布连续变量组间比较采用独立样本t检验,以均数±标准差（?x±s）表示;非正态分布计量资料采用非参数Wilcoxon秩和检验,以p50（p25,p75）表示;分类计数资料组间比较采用χ~2检验、矫正χ~2检验或Fisher精确概率法采用χ~2检验,以频数和百分率（n/%）表示;对于主要结局指标的统计分析,采用Kaplan-Meier曲线来描述其发生率,采用Log-rank检验比较其在两组间的差异,对于两组间发生率的比较采用χ~2检验。采用多因素Cox回归分析识别出对术后新发房颤有显著作用的变量。在各项统计分析中P＜0.05被认为差异具有统计学意义。第二部分:将体重2.8-3.4 kg雄性成年新西兰大耳白兔30只,随机分为5组:1.空白对照组（Control,n=6）;2.假手术组（Sham,n=6）;3.假手术+二甲双胍组（Sham+Met,n=6）;4.左心房快速起搏组（RAP,n=6）;5.左心房快速起搏+二甲双胍组（RAP+MET,n=6）。适应性分笼喂养一周以充分适应环境消除应激。在手术开始前4周,给予RAP+Met组、Sham+Met组兔每日1次二甲双胍300 mg/kg灌胃（溶解于生理盐水中）。其余组给予等量生理盐水灌胃,每日1次,持续4周。造模前行心脏超声,测量左心房内径、左房容积和左房射血分数等数据。造模,左侧3-4肋间开胸,植入子埋入皮下,两根心电采集电极导线缝合置于右侧腋下皮下与左侧前下胸壁,两根刺激电极导线分别缝合于左心耳和左心房上。通过Power Lab电生理监视记录仪连续监测心电信号,并通恒压刺激软件,以刺激2s暂停2s、频率20Hz、强度2 m A、脉宽1 ms的参数刺激2周,若出现持续的自发性心房颤动,则刺激终止,否则刺激满2周（Sham组为将两根刺激电极导线分别缝合于左心耳和左心房上,但不进行电刺激）。RAP+Met组、Sham+Met组兔术后继续给予二甲双胍灌胃,持续2周。其余组行生理盐水灌胃（灌胃方法同术前）。刺激满2周后行心脏超声,测量左心室容积、左心房容积等数据。测量完毕模型处死,在心脏未停止跳动时取完出整心脏,以低温灌注液浸泡,保持心脏跳动状态下构建Langendorff离体心脏灌注模型,以心脏电生理三维标测系统测量左心房电生理改变。测毕,剪取心房样本,部分置于-80℃冻存备用,部分置于4%的多聚甲醛浸泡固。通过H-E染色观察心房细胞的病理改变,通过Masson染色检测相关组别兔左房纤维化程度。通过采用酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）方法检测相关组别兔心房组织肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α,TNF-α）、白介素-1β（Interleukin-1β,IL-1β）、白介素6（Interleukin-6,IL-6）、甘油三酯和游离脂肪酸的含量。通过蛋白印迹（Western blot）方法检测相关组别兔心房组织α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）、Ⅰ型胶原（CollagenⅠ）、Ⅲ型胶原（CollagenⅢ）、蛋白的表达水平。通过油红O染色检测心肌脂肪浸润程度。采用SPSS 25.0统计软件,各组数据均用?x±s表示,造模前与造模后的比较采用t检验,组间的比较采用单因素方差分析,以P＜0.05为差异有统计学意义。第三部分:将体重2.8-3.4 kg雄性成年新西兰大耳白兔78只,随机分13组:1-5组同论文第二部分;6.左心房快速起搏+ITGβ6过表达腺病毒组（RAP+Ad-ITGβ6,n=6）;7.左心房快速起搏+腺病毒空载体对照组（RAP+Ad-EGFP,n=6）;8.左心房快速起搏+ITGβ6过表达腺病毒+二甲双胍组（RAP+Ad-ITGβ6+Met,n=6）;9.左心房快速起搏+腺病毒空载体对照+二甲双胍组（RAP+Ad-EGFP+Met,n=6）;10.左心房快速起搏+TGF-β1过表达腺病毒组（RAP+Ad-TGF-β1,n=6）;11.左心房快速起搏+腺病毒空载体对照组（RAP+Ad-EGFP,n=6）;12.左心房快速起搏+TGF-β1过表达腺病毒+二甲双胍组（RAP+Ad-TGF-β1+Met,n=6）;13.左心房快速起搏+腺病毒空载体对照+二甲双胍组（RAP+Ad-EGFP+Met,n=6）。适应性分笼喂养一周以充分适应环境消除应激。在手术开始前4周,给予RAP+Met组、Sham+Met组、RAP+Ad-ITGβ6+Met组、RAP+Ad-TGF-β1+Met组、RAP+Ad-EGFP+Met组兔每日1次二甲双胍300 mg/kg灌胃（溶解于生理盐水中）。喂养过程与造模方法同第二部分。干扰病毒组在两根刺激电极间的心房组织中随机选取8个注射点位分别注射ITGβ6、TGF-β1过表达腺病毒和空白对照病毒。通过Power Lab电生理监视记录仪连续监测心电信号,通恒压刺激软件,以刺激2s暂停2s、频率20 Hz、强度2 m A、脉宽1 ms参数刺激2周,若出现持续的自发性心房颤动,则刺激终止,否则刺激满2周。RAP+Met组、Sham+Met组、RAP+Ad-ITG-β6+Met组、RAP+Ad-TGF-β1+Met组、RAP+Ad-EGFP+Met组兔术后继续给予二甲双胍灌胃,持续2周。余组灌胃等量生理盐水,方法同第二部分。所有组刺激满2周后处死,剪取心房样本,部分置于-80℃冻存备用,部分置于4%的多聚甲醛浸泡固。高通量测序（全转录组测序）委托北京博奥晶典生物技术有限公司进行,以RNA-seq技术对不同条件下心房快速起搏兔模型左心房组织样本的m RNA进行转录组测序。对测序结果整理,并进行生信分析。通过RT-PCR方法检测相关组别兔心房ITGβ6、TGF-β1、基质金属蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2,MMP-2）、基质金属蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9,MMP-9）表达水平。通过Western blot方法检测相关组别兔心房组织ITGβ6、TGF-β1、p Smad-2/3、MMP-2/9蛋白的表达水平。通过IHC方法检测相关组别ITGβ6、TGF-β1蛋白的表达水平。通过Masson检测相应组别中心房纤维化程度。采用SPSS 25.0统计软件,各组数据均用?x±s表示,造模前与造模后的比较采用t检验,组间的比较采用单因素方差分析,以P＜0.05为差异有统计学意义。结果:第一部分:1.我们发现对于接受OPCABG术的T2DM患者而言,与非Met组的患者相比,Met组的患者的术前空腹血糖、术后24h、48h、96h的空腹血糖水平差异无统计学意义（P＞0.05）。与非Met组的患者相比,Met组的患者术前外周血纤维蛋白原含量、术后48h CRP、术后48h BNP水平明显降低,两组间的差异有统计学意义（P＜0.05）。服用Met能够降低POAF的发生率,并减少POAF患者胺碘酮的使用（P＜0.05）。2.通过多因素COX回归分析显示,调整术前纤维蛋白原、术后48h CRP、术后48h BNP因素后服用二甲双胍仍可降低POAF的发生风险,提示术前纤维蛋白原、术后48h CRP、术后48h BNP水平是OPCABG术后T2DM患者发生POAF的危险因素。第二部分:1.Control组、Sham组、Sham+Met组、RAP组、RAP+Met组之间的各个时间点的血糖水平比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。2.与RAP刺激前相比,经过2周的RAP刺激使模型左房LAD、LAVmax、LAVmin等指标显著增大,LAEF显著降低（P＜0.05）。与Sham组相比,RAP组兔左心房的LAD、LAVmax、LAVmin等指标均显著增加,LAEF显著降低（P＜0.05）,H-E染色结果显示心肌细胞萎缩,细胞外基质丰富,Masson染色结果显示心房纤维化水平显著增加（P＜0.05）、Western blot结果显示α-SMA、Collagen-I、Collagen-III蛋白表达显著升高（P＜0.05）;与RAP组相比,RAP+Met组的左房LAD、LAVmax、LAVmin等指标显著降低,LAEF显著升高（P＜0.05）,心肌细胞病理改变减轻,细胞外基质减少,心房纤维化水平显著降低（P＜0.05）,α-SMA、Collagen-I、Collagen-III蛋白表达显著下降（P＜0.05）,此结果说明经过6周的二甲双胍治疗可减轻RAP引起的左房扩大与功能障碍,减轻心房纤维化水平,有效改善左房的结构重构。3.通过心脏电生理检测结果发现,与Sham组相比,RAP组的兴奋传导方法离散度增加、传导速度降低、有效不应期降低（P＜0.05）;与RAP组相比,RAP+Met组的电传导一致性、传导速度的降低和有效不应期缩短均得到改善（P＜0.05）,说明经过6周的二甲双胍治疗可有效改善左房的电重构。4.通过油红染色与ELISA发现,与Sham组相比,RAP心肌脂肪浸润程度加重、心肌甘油三酯和游离脂肪酸含量显著升高（P＜0.05）;与RAP组比较,RAP+Met组心肌脂肪浸润程度减轻,心肌内甘油三酯和游离脂肪酸含量显著下降（P＜0.05）。说经过6周的二甲双胍治疗可改善RAP引起的心肌脂肪浸润。5.通过ELISA检测结果发现,与Sham组相比,RAP组兔左心房组织中TNF-α、IL-1β、IL-6的水平显著升高（P＜0.05）;与RAP组相比,RAP+Met组的左房中TNF-α、IL-1β、IL-6的水平显著下降（P＜0.05）,说明经过6周的二甲双胍治疗可减轻RAP引起的炎症反应。第三部分:1.通过高通量转录组测序及生信分析结果发现,细胞外基质结构和功能相关基因在快速起搏诱导心房纤维化兔模型心房组织内改变明显,Sham组、RAP组与RAP+Met组相比较,表达差异性显著的基因包括ITGβ6、TGF-β1、MMP-2及MMP-9等。2.通过Western blot和IHC检测结果发现,与Sham组相比,RAP组左心房内的ITGβ6、TGF-β1、p Smad-2/3、MMP-2/9蛋白的表达显著升高（P＜0.05）;与RAP组相比,RAP+Met组经过6周的二甲双胍治疗,可显著降低左心房的ITGβ6、TGF-β1、p Smad-2/3、MMP-2/9蛋白的表达（P＜0.05）。3.通过Western blot和IHC检测结果发现,与RAP+Ad-EGFP组相比,RAP+Ad-TGF-β1组的TGF-β1表达明显增加,并且ITGβ6的表达也随之增加（P＜0.05）;与RAP+Ad-TGF-β1组相比,RAP+Ad-TGF-β1+Met组的TGF-β1表达显著下降,而ITGβ6的表达也随之下降（P＜0.05）。与RAP+Ad-EGFP组相比,RAP+Ad-EGFP+Met组的TGF-β1蛋白下调,并且ITGβ6蛋白表达也随之下降（P＜0.05）;与RAP+Ad-TGF-β1+Met组相比,RAP+Ad-EGFP+Met组的TGF-β1蛋白下调,并且ITGβ6蛋白表达也随之下降（P＜0.05）。通过Masson染色结果发现,与RAP+Ad-EGPF组相比,RAP+Ad-TGF-β1组的心房纤维化程度明显增加（P＜0.05）,RAP+Ad-EGFP+Met组的心房纤维化程度明显降低（P＜0.05）;与RAP+Ad-TGF-β1+Met组相比,RAP+Ad-TGF-β1组的心房纤维化程度明显增加（P＜0.05）,RAP+Ad-EGFP+Met组的心房纤维化程度明显减低（P＜0.05）。由此进一步证实二甲双胍可通过抑制TGF-β1的表达减轻心房纤维化程度。4.与RAP+Ad-EGFP组相比,RAP+Ad-ITGβ6组的ITGβ6表达明显增加,并且TGF-β1的表达也随之增加（P＜0.05）;与RAP+Ad-ITGβ6组相比,RAP+Ad-ITGβ6+Met组的ITGβ6表达显著下降,而TGF-β1的表达也随之下降（P＜0.05）。与RAP+Ad-EGFP组相比,RAP+Ad-EGFP+Met组的ITGβ6蛋白下调,并且TGF-β1蛋白表达也随之下降（P＜0.05）;与RAP+Ad-ITGβ6+Met组相比,RAP+Ad-EGFP+Met组的ITGβ6蛋白下调,并且TGF-β1蛋白表达也随之下降（P＜0.05）。通过Masson染色结果发现,与RAP+Ad-EGPF组相比,RAP+Ad-ITGβ6组的心房纤维化程度明显增加（P＜0.05）,RAP+Ad-EGFP+Met组的心房纤维化程度明显降低（P＜0.05）;与RAP+Ad-ITGβ6+Met组相比,RAP+Ad-ITGβ6组的心房纤维化程度明显增加（P＜0.05）,RAP+Ad-EGFP+Met组的心房纤维化程度明显减低（P＜0.05）。由此进一步证实二甲双胍可通过抑制ITGβ6的表达减轻心房纤维化程度。结论:第一部分:1.与未服用二甲双胍的T2DM患者相比,服用二甲双胍能够降低T2DM患者术前纤维蛋白原水平,降低OPCABG术后体内炎症水平,降低POAF的发生风险并减少房颤患者胺碘酮药物的使用,且这种影响与血糖水平无关。2.对于T2DM患者,术前纤维蛋白原、术后48h CRP、术后48h BNP水平是OPCABG术后发生POAF的危险因素。第二部分:1.RAP加重了兔左心房脂肪与炎症浸润程度,加重了左房反应性纤维化程度,引起了电传导障碍,增加了房颤的易感性,而经过6周的二甲双胍治疗后,可显著降低左房的脂肪与炎症浸润水平,减轻左房反应性纤维化程度和电传导障碍,从而降低房颤的易感性,并且上述改变与血糖水平无关。第三部分:1.RAP诱导心房纤维化模型的左房中ITGβ6、TGF-β1、p Smad-2/3、MMP-2/9蛋白的表达上调,二甲双胍可以抑制上述改变,降低上述蛋白的表达上调。2.ITGβ6与TGF-β1信号分子通过环状反馈的方式相互促进,共同介导了RAP兔左房纤维化改变,增加房颤的易感性。3.6周的二甲双胍治疗可通过抑制ITGβ6/TGF-β1信号通路减轻RAP兔左房纤维化改变,降低房颤的易感性。