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目的:研究人骨形态发生蛋白7(humanBoneMorphogeneticProtein7,hBMP7)成熟区及全长cDNA的克隆方法并进行测序及序列分析.利用基因工程技术构建人骨形态发生蛋白7重组腺病毒(Recombinant Adenovirus,rAd),并进行体内表达,测定活性,为深入研究其体内活性,诱骨机理及临床应用前景都起到积极作用,也为深入开展基因治疗研究创造了条件.方法:采用异硫氰酸胍一步法从人胎儿肾中提取总RNA,以逆转录-聚合酶链反应扩增BMP7成熟区cDNA基因片段.将此基因片段导入克隆载体pGEM-T-easy中,获得重组质粒pGEM-T-rhBMP7mature.采用Sanger双脱氧链末端终止法测定基因序列.同样采用RT-PCR方法,从人胎儿肾中分段克隆出BMP7基因全长5端和3端基因片段,将其分别装入克隆载体pGEM-T-easy中,经Pst Ⅰ/HindⅢ酶切连接后,获得重组质粒pGEM-T-BMP7.测定核酸序列后经限制性内切酶BamH Ⅰ/HindⅢ双酶切后,琼脂糖凝胶电泳回收1.3kb左右的全长基因片段;pACCMVplpA复制缺陷型腺病毒穿梭质粒经限制性内切酶BamH Ⅰ和HindⅢ双酶切回收质粒大片段约8.8 kb;两回收片段连接后,即将rhBMP7全长基因定向克隆入腺病毒穿梭质粒,构建pACCMV/rhBMP7穿梭质粒,利用磷酸钙-DNA共沉法将穿梭质粒pACCMV/rhBMP7及包装质粒PJM17共转染293细胞,经细胞内同源重组后,构建骨形态发生蛋白7重组腺病毒AdCMV/rhBMP7,7天后收取噬斑,并用其感染培养至对数生长期的293细胞,5天后将大片脱落的细胞收集起来,冻融三次后离心取上清备用;继续扩增纯化AdCMV/rhBMP7,用含有重组腺病毒的毒液再次感染293细胞,收取脱落的细胞并冻融,收集上清保存于4℃备用;将保存的病毒液取出,测定滴度.