水稻稻曲病是一种水稻穗部病害,现已由次要病害上升为主要病害。稻曲病菌(Ustilaginoideavirens)是稻曲病的病原真菌,在穗部形成的稻曲球严重影响水稻品质和产量,稻曲球产生的毒素能对人畜健康产生危害。因此深入了解稻曲病的致病机理,可以为水稻稻曲病的防治提供理论依据。1、本文从稻曲病菌T-DNA插入突变体库中筛选到一株致病力减弱的突变菌株B2510,通过分析突变菌株B2510的生物学性状和T-DNA插入位点的侧翼基因,为稻曲病菌的分子致病机理的研究提供方法和理论依据。与野生型P1相比,突变菌株B2510丧失了产孢能力,生长速率在MM培养基上明显降低,而在PSA和TB3培养基中则没有显著差异。Southern杂交分析T-DNA的拷贝数,结果显示T-DNA以双拷贝形式插入到突变菌株B2510的基因组中。运用hiTAIL-PCR技术扩增T-DNA插入位点的侧翼序列,获得两个可能与致病性有关的基因UVC6TF和UVRASGAP。T-DNA分别插在基因UVC6TF的启动子区域和UVRASGAP的下游3’端,且稻曲基因组和T-DNA序列均未丢失。半定量RT-PCR分别分析两个基因在突变菌株B2510中的表达量,发现与P1相比均显著下降。因此推测这两个基因与稻曲病菌致病性相关,可能在某一阶段参与调控稻曲病菌在水稻上的致病过程。为进一步了解基因的功能,构建基因UVC6TF的沉默载体,并通过ATMT的方法导入稻曲病菌。获得的2个沉默转化子中UVC6TF的表达分别被抑制了 50%和90%,分析它们的产孢量、生长速率等生物学性状和致病力检测。结果发现该基因不影响菌株正常的生长发育,但是对分生孢子的产生过程有一定的调控作用。产孢能力降低,从而使其致病能力减弱。此外,T-DNA插入还破坏了基因UVRASGAP的表达,下一步计划则是对单个基因或是两个基因进行基因敲除、回补等方法进一步研究基因功能,对稻曲病菌致病过程的解析具有重要意义。2、真菌对铁离子的运输有着特殊的机制。铁转运蛋白参与细胞内铁离子的跨膜运输,有时也可作为二级调控影响基因的表达和机制,对保持体内铁离子的平衡和菌株致病因子的产生具有重要意义。Uvt3277是低亲和力铁转运蛋白,且有研究阐明可能与稻曲病菌的致病过程相关。本研究则对基因Uvt3277的功能进行进一步地验证。构建发夹结构沉默载体,用农杆菌介导转化的方法(ATMT)导入稻曲病菌中:分析沉默转化子的表型,来验证低铁转运蛋白在稻曲病菌的生长发育、致病性的关系。结果发现沉默菌株的生长速率与野生菌株P1相比有一定的降低,但基因沉默效率与生长速率之间没有明显的线性关系,说明基因Uvt3277可能协同其他调控因子影响稻曲病菌的生长发育。铁胁迫性测定发现在一定的Fe2+浓度下,沉默菌株能够利用Fe2+正常生长。另外,沉默菌株的致病能力都比P1强,表明铁转运蛋白在一定程度上影响到致病相关的负调控途径。同时酵母双杂交技术筛选出低铁转运蛋白的互作蛋白,从而进一步为稻曲病菌致病机理的研究提供理论基础。但是筛选到的候选蛋白太少,只得到两个疑似蛋白:ATP/ADP carrier(AAC)protein和SH3 domain-containing protein,因此还需进行验证或重新酵母双杂交筛选。