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目的研究建立从明日叶中提取查尔酮(Angelica keiskei Koidzumi chalcone,英文简称AC)的方法并制备实验样品。应用紫外光谱、红外光谱、高效液相色谱法等技术手段检测明日叶查尔酮的含量及其结构特征;釆用动物实验的方法,观察明日叶查尔酮对小鼠H22肝癌血管生成的抑制作用。方法包括明日叶查尔酮的制备分析与对小鼠H22肝癌血管生成的抑制作用等两部分内容的实验方法:1明日叶查尔酮的提取、纯化与分析1.1明日叶查尔酮的提取以新鲜明日叶为原料,经制浆→溶剂萃取→样品收集、处理→提取量检测及得率计算等方法步骤获得查尔酮粗品,通过分别考察提取剂组分、料液比、提取时间、温度及次数等单因素及其多因素(正交实验法)对提取效果的影响情况,最终筛选出最佳提取工艺条件。1.2明日叶查尔酮的纯化将提取的明日叶查尔酮粗品采用层析法,经醇溶→过滤→上柱吸附(聚酰胺或大孔树脂)→水洗→脱附→检验→浓缩→干燥等工艺处理后,获得明日叶查尔酮纯品。1.3制备样品的分析1.3.1制备样品中查尔酮的含量测定将纯化样品经硝酸铝显色测定吸光度,而后由芦丁标准样线性回归方程得出样品中查尔酮的含量,进而计算提取得率和样品纯度。回归方程:CX(mg/m L)=(Y+0.0002)/0.484CX—样品中查尔酮浓度(mg/m L)Y—样品的吸光度A提取得率:粗品(%)=粗品重量/明日叶重量×100%纯品(%)=纯品重量/明日叶重量×100%样品纯度:粗品(%)=查尔酮含量/粗品重量×100%纯品(%)=查尔酮含量/纯品重量×100%1.3.2制备样品的紫外光谱分析用紫外光谱法测定制备的明日叶查尔酮样品的基本骨架结构。1.3.3制备样品的红外光谱分析用红外光谱法测定制备的明日叶查尔酮样品的特征吸收峰。1.3.4制备样品的高效液相色谱分析用高效液相色谱法测定制备的明日叶查尔酮样品的组分。2明日叶查尔酮对肝癌血管生成的抑制作用研究2.1动物实验方法将原代H22肝癌细胞接种于小鼠腹腔,在接种后第6天,无菌条件下抽取腹水并制备成肝癌细胞悬液,在每只受试小鼠的右腋窝处接种2m L。设肿瘤对照组、低、中、高剂量明日叶查尔酮组和恩度组共5个组,每组10只,雌雄各半。明日叶查尔酮剂量组分别为5、25、50 mg/kg,每天经口灌胃给药1次,连续10天。恩度组和肿瘤对照组则给予生理盐水灌胃,恩度组腹腔注射恩度经口灌胃等量生理盐水4mg/kg剂量。各组均在接种后第11天摘眼球取血并处死动物,取瘤组织待检。2.2检测指标2.2.1瘤质量和抑瘤率:用电子天平称取小鼠瘤重并计算得出抑瘤率。抑瘤率=[肿瘤对照组瘤质量(g)-用药组瘤质量(g)]/肿瘤对照组瘤质量(g)×100%2.2.2瘤细胞增殖活性:用四甲基偶氮唑(MTT)法检测各组小鼠肿瘤细胞的增殖活性。2.2.3瘤组织中微血管密度(MVD)、血管内皮生长因子(VEGF)表达水平:用免疫组化法检测。2.2.4瘤组织中缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)浓度检测:用酶联免疫吸附实验(ELISA)法检测。结果1明日叶查尔酮的提取、纯化与分析1.1明日叶查尔酮的提取明日叶查尔酮粗品的最优制备工艺为:采用水-乙醇二元萃取体系,水:乙醇体积分数35:65,温度60℃,时间1 h,料液比1:10,提取1次,粗品提取得率为3.38%。1.2明日叶查尔酮的纯化聚酰胺层析柱分离法纯化明日叶查尔酮优于AB-8大孔树脂分离法,经纯化后与先前制得的粗品相较纯度提升12倍以上。1.3制备样品的分析1.3.1制备样品中查尔酮的含量测定制备的查尔酮粗品及纯品中查尔酮的含量分别为0.575 mg与7.250 mg,纯度则分别为7.71%及96.6%。1.3.2明日叶查尔酮的紫外光谱分析制备的查尔酮纯品在380 nm处有最大吸收,与标准查尔酮样品相同。1.3.3明日叶查尔酮的红外光谱分析制备的查尔酮纯品红外光谱显示,其结构中含有酚羟基、羰基、甲基、亚甲基、碳氧键和苯环结构等明日叶查尔酮衍生物应具备的结构特征。1.3.4明日叶查尔酮的高效液相色谱分析制备的明日叶查尔酮样品是含有的8种查尔酮衍生物的混合物。本工艺未获得单一成分的明日叶查尔酮衍生物。2明日叶查尔酮对肝癌血管生成的抑制作用研究2.1瘤重及抑瘤率:肿瘤对照组与高剂量AC组的平均瘤重分别为0.548±0.021g与0.332±0.032g,低剂量与高剂量AC组抑瘤率分别为4.20%、39.42%,差异均有显著性意义(p<0.05)。2.2瘤细胞增殖活性:中、高剂量AC组肿瘤细胞增殖活性分别为0.657±0.073、0.506±0.032,较肿瘤对照组(1.330±0.089)显著性降低(P<0.05)。2.3 MVD和VEGF表达:中、高剂量AC组MVD计数分别为7.2±1.135、4.5±1.286,与肿瘤对照组(9.9±1.175)比较,均有显著性差异(P<0.05);中、高剂量AC组的VEGF阳性表达率分别为26.12%和12.22%,与肿瘤对照组(56.26%)相比差异有显著意义(P<0.05)。2.4 HIF-1α浓度:中、高剂量AC组HIF-1α浓度分别为81.16±10.31ng/L、77.34±11.39ng/L,肿瘤对照组则为88.92±11.73ng/L,二者差异具有显著意义(P<0.05)。结论本研究通过上述实验结果得出以下结论:1.本研究以新鲜明日叶为原料,经过对四种萃取体系的优化工艺条件和提取得率进行比较,最终建立明日叶查尔酮粗提品的最优制备工艺为:采用水-乙醇二元萃取体系,水:乙醇体积比35:65,温度60℃,时间2h,料液比1:10,提取1次,提取得率为3.38%。2.查尔酮粗提品经过层析法纯化工艺处理后,纯度提高12倍以上,说明色谱分离柱的分离提纯效能显著。聚酰胺层析柱分离提纯效果好于AB-8大孔树脂。3.经提取纯化的明日叶查尔酮样品在紫外380 nm处有最大吸收;红外光谱显示该样品含有酚羟基、羰基、甲基、亚甲基、碳氧键和苯环结构,具备明日叶查尔酮衍生物应有结构特征;高效液相色谱分析结果则证明该样品含有8种查尔酮衍生物组分。4.明日叶查尔酮可抑制肝癌细胞的增殖活性和肿瘤的生长,下调瘤细胞中MVD、VEGF的表达水平,降低HIF-1α的浓度,表明明日叶查尔酮对小鼠H22肝癌及其血管生成有一定抑制作用。5.本研究创新点主要有:(1)建立了一种直接从新鲜明日叶中直接提取查尔酮的方法。该方法具有快速、高效、绿色、节能、操作简便的特点,适合工业化应用。该方法申请了国家发明专利并已获得授权。(2)建立了从新鲜明日叶中提取、纯化、检测查尔酮的整套方案,研究的系统性和可操作性较强,在国内外尚属首次。(3)在国内外首次研究了明日叶查尔酮对H22肝癌血管生成的抑制作用,为今后其在抗肿瘤作用机制和靶向药的开发利用提供了新的实验依据。