【摘 要】
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研究目的:1、研究QD550-链霉亲和素（Streptavidin,SA）及生物素化二抗复合物的物理和光化学性质,确定二者是否成功偶联,并验证QDs是否为一种适用于生物医学的荧光染料。2、研究量子点免疫荧光信号放大系统在HeLa细胞上的应用,并优化染色条件,探究量子点免疫荧光信号放大系统在宫颈组织染色的最优条件。3、检测宫颈病变组织中P16INK4A的表达水平,并探讨P16INK4A与临床病理因素
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研究目的:1、研究QD550-链霉亲和素（Streptavidin,SA）及生物素化二抗复合物的物理和光化学性质,确定二者是否成功偶联,并验证QDs是否为一种适用于生物医学的荧光染料。2、研究量子点免疫荧光信号放大系统在HeLa细胞上的应用,并优化染色条件,探究量子点免疫荧光信号放大系统在宫颈组织染色的最优条件。3、检测宫颈病变组织中P16INK4A的表达水平,并探讨P16INK4A与临床病理因素之间的相关性。4、对比量子点免疫荧光信号放大系统染色与免疫组化染色,验证其在实际应用中的可行性及优越性。研究方法:通过活泼酯法分别将QD550与SA偶联,生物素和兔抗鼠Ig G二抗偶联,采用动态光散色仪（Dynamic Light Scattering,DLS）、透射电子显微镜（Transmission electron microscope,TEM）、荧光光谱仪（Fluorescence spectrometer）及紫外分光光度计（Ultraviolet spectrophotometer）对其进行表征,验证其偶联是否成功。以鼠源抗P16INK4A抗体为一抗,使用QD550-生物素链霉亲和素系统（Biotin-Streptavidin（SA）system,BAS）对Hela细胞进行免疫荧光染色,在倒置荧光显微镜下观察其荧光标记效果,分析比较其荧光强度,初步验证BAS的信号放大效果。同时选取不同摩尔比的QD550/SA、生物素/二抗以及不同的一抗孵育时间来分别对HeLa细胞进行染色,通过对比荧光强度获得最佳反应条件。最后通过QD550-BAS系统对30例正常宫颈（NC）、14例CIN Ⅰ、30例CIN Ⅱ、31例CIN Ⅲ、32例宫颈鳞癌（CSCC）以及25例宫颈腺癌（CAC）组织进行免疫染色,检测上述宫颈组织内的P16INK4A的表达水平,并与免疫组化（IHC）及HE染色进行对比,同时验证P16INK4A表达水平与临床病理因素之间的相关性。结果:1、本研究所用QD550-SA以及生物素化二抗复合物经动态光散射仪、荧光光谱分析及紫外光谱分析均表明成功偶联,且研究所用QD550粒子形状规则呈球形、大小均一、直径小、且具有良好的单分散性,发射光谱连续且对称。2、在HeLa细胞染色中量子点荧光强度高于有机染料FITC,初步验证BAS对于QDs染色具有明显的信号放大作用,且特异性较好。3、在染色条件的选择上,1:50摩尔比的生物素化二抗复合物、1:40摩尔比的QD550-SA复合物以及2 h的一抗孵育时间为最适宜条件。4、QD550-BAS检测NC、CIN Ⅰ、CIN Ⅱ、CIN Ⅲ、CSCC以及CAC组织中P16INK4A的阳性率分别为0%（0/30）、35.7%（5/14）、70%（21/30）、84.6%（26/31）、96.9%（31/32）以及96%（24/25）,其检测灵敏度和特异度分别为81.1%和100%,明显高于IHC的67.4%及83.3%,差异具有统计学意义（P<0.05）。P16INK4A蛋白表达水平随着宫颈病变程度、组织分化程度及临床分期程度的增高而增高,且淋巴转移及远处转移也会影响其表达。结论:1、QDs直径小、光学特性优、生物相容性高,适用于生物医学研究。2、宫颈病变组织中P16INK4A过表达,而正常宫颈组织中不表达,且P16INK4A蛋白的表达与宫颈癌浸润侵袭以及转移密切相关,有望成为宫颈癌诊断及靶向治疗的一个参考。3、QDs-BAS荧光染色技术较传统的IHC有较明显的优势,在肿瘤的检测上有一定的应用前景。
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