苏云金芽胞杆菌LM1212晶体细胞分化相关转录因子的鉴定

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苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)LM1212菌株的芽胞和晶体在不同细胞内产生,具有细胞分化现象。使用Pacbio RSII测序平台对LM1212菌株进行了测序,得到了6320549bp的全基因组图谱。LM1212菌株有1个genome和8个质粒,共有12个cry/cyt基因分别位于质粒pLM248、pLM158及pLM113上。采用高温法对含有cry35-like基因启动子与lacZ基因融合质粒的LM(p35’Z)菌株的内源大质粒基因进行缺失。筛选得到两株质粒基因缺失突变株LM(p35’Z)-W菌株和LM(p35’Z)-DB菌株,且cry35-like基因启动子Pcry35-like的活性在这两株菌中受到影响;激光共聚焦扫描显微镜和光学显微镜观察、芽胞形成率分析及利用SDS-PAGE和LC-MS/MS(Q-TOF)质谱分析质粒基因缺失对LM1212细胞分化和晶体蛋白表达的影响,结果表明LM(p35’Z)-DB菌株形成更多晶体产生细胞,LM(p35’Z)-W菌株形成较少晶体产生细胞;LM(p35’Z)-DB菌株晶体蛋白产量提高,LM(p35’Z)-W菌株晶体蛋白产量减少。基于pLM248的orf设计了一系列引物鉴定缺失区域,发现在LM(p35’Z)-W菌株中的pLM248上缺失的orf28-32可能对Pcry35-like启动子表达起着重要的作用。为了验证orf28-32片段在LM1212中的功能,选取缺失orf28-32片段的LM(p35’Z)-W菌株作为实验菌株,通过高温无抗性培养筛选到缺失p35’Z载体的LM(p35’Z)-W?p35’Z菌株。将pHT304-orf28-29载体及pHT304-orf28-32转进LM(p35’Z)-W?p35’Z菌株,结果表明orf28-29及orf28-32均可提高晶体细胞比例,对LM1212细胞分化产生影响。SDS-PAGE分析发现orf28-29及orf28-32均可提高晶体蛋白产量。将orf28编码的转录因子命名为CpcR(Crystal producer cell regulator)。LM(p35’gfp)菌株携带Pcry35-like启动子融合gfp的表达载体,使用激光共聚焦扫描显微镜观察LM(p35’gfp)菌株从T0到T4共5个时间点的gfp基因表达情况,结果表明LM1212菌株在T2开始了分化。分别提取LM(p35’gfp)菌株,LM(p35’Z)-W菌株和LM(p35’Z)-DB菌株从T0到T4的总RNA进行测序,分别得到了以上三株菌分化前后5个时间点的转录组数据,为后续分析转录因子CpcR的调控基因及通过分析差异表达基因的结合蛋白进而找出其它调控分化的转录因子奠定了基础。
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