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氟是一种非金属化学元素,广泛分布在自然界中,也是人体必需的微量元素,它可通过水、空气和土壤等介质进入人体,造成人体长期过量摄入,在机体中积累,从而引起机体损伤,称为地方性氟中毒,主要表现在骨骼和牙齿上,临床上称为氟骨症和氟斑牙。人体过量氟会通过胎盘屏障进入子代机体,并在子代机体中积累,并透过血脑屏障影响子代脑发育。低钙膳食可能是氟中毒的主要诱发和促进因素之一,能引起内质网过度应激,增加脑细胞凋亡率,增强氟对神经毒性作用,而高钙膳食能明显减轻氟中毒引起的机体损伤。氟中毒对脑发育及其功能损伤的相关研究已较深入,膳食钙对氟中毒致骨相器官损伤影响的也有所报道,但膳食钙对氟中毒致非骨相器官,特别是对脑损伤影响却鲜有报道。本实验在实验室前期研究的基础上,探讨内质网应激在不同钙营养条件下氟暴露致仔鼠脑细胞凋亡中的作用及分子机理,探寻钙对母鼠氟暴露致仔鼠脑细胞凋亡影响的分子机理,评价饮食钙对氟中毒的干预作用,为地氟病的防治提供基础资料。实验时选择清洁级健康初断乳的SD雌性的大鼠共50只,雄性的大鼠共25只(供交配),适应一周之后,随机分成5个组。对照组(Control)饮食自来水(水中氟含量<0.2 mg/L)联合常食饲料(钙含量0.79%);高氟组(F)饮食100 mg/L的NaF溶液联合常食饲料;低钙组(LCa)饮食自来水联合低钙饲料(钙含量0.063%);高氟低钙组(F+LCa)饮食100 mg/L的NaF溶液联合低钙饲料;高氟高钙组(F+HCa)饮食100 mg/L的NaF溶液联合高钙饲料(钙含量7%)。雄性大鼠饮用自来水,食用标准饲料(水中氟含量<0.2 mg/kg,钙含量为7～10 g/kg);溶剂均为自来水。雌鼠染毒3个月后,以母鼠氟斑牙及血/尿氟含量作为亚慢性氟中毒动物模子复制成型的标准,之后以雄性和雌性比例为1:1合笼交配,取胎鼠、14天及28天日龄仔鼠进行相关的测试实验。实验各组均采用母/仔鼠体重和仔鼠血/尿氟、血/尿钙含量、凋亡情况、脑海马神经细胞内质网应激伴侣分子BIP、CHOP、CRT蛋白/基因及脑海马神经细胞相关凋亡信号通路分子Bcl-2、Caspasel2、JNK蛋白/基因表达水平作为观察指标。实验结果如下:(1)氟中毒动物模型的检测结果:氟暴露3个月之后观察母鼠切齿氟斑牙症状,跟对照组对比,F组与F+LCa组切齿外轮廓出现清晰黄色和白色相间条纹,氟斑牙症状显著,有白斑或者缺损;F+HCa组切齿外轮廓有轻微的黄色和白色相间条纹,氟斑牙症状较轻。跟对照组对比,F+LCa组的血氟的浓度显著性升高(p<0.05),F组和F+LCa组母鼠尿氟浓度均极显著上升(p<0.01),F+HCa组母鼠尿氟浓度显著性下降(p<0.05)。以上结果表明,母鼠氟暴露3个月以后,亚慢性氟中毒动物模型复制成型。(2)体重称量结果:跟对照组对比,LCa组和F+LCa组母鼠体重均极显著减少(p<0.01),F组和F+HCa组母鼠体重均无显著性差异(p>0.05);14日龄仔鼠F组、LCa组和F+LCa组得仔鼠体重均极显著减少(p<0.01)F+HCa组仔鼠体重无显著性差异(p>0.05);28日龄仔鼠LCa组和F+LCa组仔鼠体重均极显著减少(p<0.01),F组和F+HCa组得仔鼠体重均显著性减少(p<0.05)。(3)血氟/钙与尿氟/钙含量测定结果:跟对照组对比,F+LCa组血氟浓度均极显著增加(p<0.01),14日龄雄鼠F组血氟浓度均显著性增加(p<0.05),28日龄雄鼠F组血氟浓度极显著增加(p<0.01);14日龄雄鼠和28日龄仔鼠LCa组和F+LCa组血钙的浓度均极显著减少(p<0.01),14日龄雌鼠F+LCa组血钙含量显著减少(p<0.05),28日龄雌鼠F+HCa组血钙含量显著性增加(p<0.05),28日龄雄鼠F+HCa组血钙含量极显著增加(p<0.01);各组仔鼠F组和F+LCa组尿氟含量均极显著增加(p<0.01),F+HCa组尿氟含量显著性增加(p<0.05);各组仔鼠LCa组和F+LCa组尿钙浓度均极显著减少(p<0.01),14日龄雄鼠和28日龄仔鼠F+HCa组尿钙含量极显著增加(p<0.01),14日龄雌鼠F+HCa组尿钙含量显著性增加(p<0.05)。跟F组对比,14日龄仔鼠F+LCa组血氟浓度均极显著增加(p<0.01),28日龄仔鼠和14日龄雄鼠LCa组血氟含量显著性减少(p<0.05);14和28日龄雄鼠F+LCa组血钙含量极显著减少(p<0.01),14和28日龄雌鼠F+LCa组血钙含量显著性减少(p<0.05),28日龄仔鼠F+HCa组血钙含量极显著增加(p<0.01),28日龄仔鼠LCa组血钙含量显著性减少(p<0.05);各组仔鼠LCa组尿氟含量极显著减少(p<0.01),F+HCa组尿氟含量显著性减少(p<0.05);各组仔鼠的LCa组和F+LCa组尿钙的浓度均极显著减少(p<0.01),28日龄仔鼠和14日龄雄鼠F+HCa组尿钙含量极显著增加(p<0.01),14日龄雄鼠F+HCa组尿钙含量显著性增加(p<0.05)。(4)相关氧化应激血液指标测定结果:与对照相比,14日龄雌鼠F+HCa组与各组仔鼠F组和F+LCa组血清中MDA含量均极显著上升(p<0.01);各组仔鼠F组和F+LCa组血清中SOD、GSH-Px和T-AOC活力均极显著下降(p<0.01);LCa组和F+HCa组仔鼠血清中T-AOC活力均显著性下降(p<0.05)。跟F组对比,14日龄的仔鼠和28日龄的雌鼠F+LCa组的血清中MDA的浓度均极显著上升(p<0.01),28日龄仔鼠和14日龄雄鼠LCa组和F+HCa组的血清中MDA浓度均显著下降(p<0.05);各组仔鼠F+HCa组血清中SOD、GSH-Px和T-AOC活力显著性上升(p<0.05);F+LCa组血清中,28日龄仔鼠SOD、T-AOC和28日龄雌鼠GSH-Px与14日龄雌鼠SOD及14日龄雄鼠GSH-Px、T-AOC活力均显著下降(p<0.05),14日龄雌鼠和28日龄的雄鼠GSH-Px的活力均极显著下降(p<0.01);LCa组血清中,各组仔鼠T-AOC与28日龄仔鼠和14日龄雌鼠GSH-Px及14日龄仔鼠SOD活力均显著上升(p<0.05),14日龄的雄鼠GSH-Px和28日龄雄鼠SOD活力均极显著上升(p<0.01)。(5)脑海马细胞凋亡检测结果:胎鼠和仔鼠对照组和LCa组脑海马组织凋亡细胞比较少见,F组和F+LCa组凋亡细胞显著上升,F+HCa组凋亡细胞跟F组的对比有减少的趋势。(6)PCR检测结果:跟对照组对比,F组与F+LCa组胎鼠和仔鼠BIP、CHOP、CRT、Caspase12及JNK基因表达水平均极显著上升(p<0.01),Bcl-2基因表达水平均极显著下降(p<0.01);F+HCa组胎鼠和仔鼠BIP、CHOP、CRT、Caspase12及JNK基因表达水平均显著性上升(p<0.05),Bcl-2基因表达水平均显著下降(p<0.05);LCa组胎鼠和14日龄雌鼠Bcl-2基因表达水平均显著下降(p<0.05)及Caspase12和JNK基因表达水平均显著性上升(p<0.05),28日龄雄鼠的CRT基因表达水平均显著性上升(p<0.05)。跟F组对比,F+LCa组胎鼠和14日龄雌鼠及28日龄仔鼠BIP和CHOP基因与28日龄仔鼠Caspase12基因和28日龄雌鼠CRT基因表达水平均极显著上升(p<0.01),胎鼠及仔鼠Bcl-2基因表达水平均显著下降(p<0.05),胎鼠和14日龄雌鼠Caspase12和JNK基因及14日龄雄鼠Caspase12基因与28日龄的仔鼠JNK基因表达水平均显著性上升(p<0.05);LCa组胎鼠和28日龄仔鼠的BIP、CHOP、CRT基因及14日龄仔鼠的Caspase12和JNK基因表达水平均显著性下降(p<0.05),胎鼠和28日龄雄鼠Bcl-2基因表达水平均显著性上升(p<0.05),14日龄仔鼠和28日龄14日龄的仔鼠和28日龄的雌鼠的Bcl-2基因表达水平全都极显著上升(<0.01)。(7)Western blot分析结果:与对照组相比,F组和F+LCa组,胎鼠和14日龄雌鼠BIP、CHOP和CRT蛋白、14日龄雄鼠和28日龄雌鼠的BIP和CHOP蛋白、28日龄雄鼠CHOP蛋白、胎鼠和14/28日龄雄鼠Caspase12和JNK蛋白、14日龄雌鼠的JNK蛋白及28日龄仔鼠的Caspase12蛋白表达水平均极显著上升(p<0.01),胎鼠及仔鼠Bcl-2蛋白表达水平均极显著下降(p<0.01);F+HCa组,胎鼠BIP、CHOP和CRT蛋白、14日龄雌鼠BIP和CRT蛋白、14日龄雄鼠BIP、CHOP和Caspase12蛋白、28日龄雌鼠BIP和Caspase12蛋白及28日龄雄鼠的CHOP蛋白表达水平均显著上升(p<0.05),14日龄的雄鼠和28日龄的雌鼠Bcl-2蛋白的表达水平均极显著下降(p<0.01)。跟F组对比,F+LCa组的胎鼠和28日龄雄鼠BIP、CHOP和CRT蛋白、14日龄雌鼠CHOP和CRT蛋白、14日龄雄鼠BIP蛋白及28日龄雌鼠CRT、Caspasel2、JNK蛋白表达水平均显著上升(p<0.05);LCa组胎鼠、14日龄仔鼠及28日龄雌鼠BIP和CHOP蛋白表达水平均显著下降(p<0.05),胎鼠、14日龄雌鼠及28日龄雄鼠的Caspase12蛋白表达水平均显著下降(p<0.05),胎鼠及仔鼠Bcl-2蛋白表达水平均极显著上升(p<0.01)及JNK蛋白表达水平均极显著下降(p<0.01)。综上所述,母鼠饮水型氟中毒会改变子代血/尿氟浓度,降低血液中相关氧化应激酶活性,增加丙二醛含量,使脑海马神经细胞内质网应激伴侣分子BIP、CHOP、CRT基因/蛋白升高,脑海马神经细胞相关凋亡信号通路分子Caspasel2、JNK基因/蛋白表达水平也升高Bcl-2基因/蛋白表达水平却下降,从而脑海马凋亡细胞增加,最终损伤子代脑细胞。结果提示,内质网应激在不同钙营养条件下母鼠氟暴露后仔鼠脑凋亡中起重要作用,食料高钙(钙含量7%)干预母鼠饮水型氟中毒致仔鼠脑细胞凋亡的分子机理可能是通过上调Bcl-2表达、下调BIP、CHOP、CRT、Caspase12及JNK表达,从而抑制氟暴露致大鼠脑细胞凋亡过度,而母鼠食用低钙饲料(钙含量0.063%),同时饮用高氟水,会加重对仔鼠脑细胞产生毒性作用。