背景和目的:研究表明脑出血后继发性脑组织损伤过程中凋亡是细胞死亡的主要形式,可能机制包括血肿周边组织继发性的缺血、凝血酶及血红蛋白分解产物的毒性作用、自由基及各种炎性因子的介导等。脑组织含有大量的脂质,是一个对于缺氧和氧化损伤及其敏感的组织,加之脑出血后血液成份中的铁离子可以通过Fenton/Haber-Weiss反应使H2O2生成*OH增加自由基生成。所以与缺血性脑卒中相比,脑出血时自由基造成的损伤更加严重。已有研究证明抗自由基治疗可以减轻出血后的继发性损伤,减少血肿周围细胞凋亡。本研究通过使用不同剂量羟自由基清除剂对大鼠脑出血模型进行干预,观察脑组织中不同自由基水平对于神经元及胶质细胞凋亡的影响,并观察自由基对于TNF-α、caspase-3、8表达以及激活的影响,初步探讨自由基在脑出血后细胞凋亡中的作用机制。第一部分脑出血模型中自由基含量与凋亡的相关性研究(一)目的:研究脑出血后血肿周围组织不同自由基水平对于细胞凋亡的影响(二)方法:动物随机分为4组,假手术组、模型组、易达拉奉组1(1mg/kg)、易达拉奉组2(3mg/kg),各组又根据不同时间点分为6h、12h、24h、48h、72h、7d、14d七个亚组。通过立体定向技术,采用二次注血/退针方法向成年SD大鼠左尾壳核注入自体血80ul,制作大鼠脑出血动物模型,术后参照Bederson法进行神经病功能缺陷评分,判断模型成功。应用分光光度计法检测血肿周围MDA及羟自由基含量,通过免疫组化检测血肿组织周围细胞凋亡数,分析脑血后血肿周围组织自由基水平和凋亡相关性。(三)结果:1、模型组产生羟自由基能力及MDA含量较假手术组和两组药物干预组明显升高,具有显著性差异;其他各组产生羟自由基能力及MDA含量均具有显著性差异。2、假手术组于针道周围可见少量TUNEL阳性细胞,随时间变化略有增加,3天时最多,之后逐渐下降。模型组和两种剂量的药物干预组均于6h即可观察到TUNEL阳性细胞,24小时明显增加,3天时达到高峰,7d时明显减少,14天时于血肿周边仍可见少量阳性细胞。将各组间进行比较,差异均具有显著性。3、凋亡细胞数与脑组织产生自由基能力(r=0.2003)及MDA含量(r=0.6563)具有相关性。(四)结论:脑出血后细胞凋亡数和自由基水平变化趋势相同,二者具有相关性,表明自由基对于出血后脑组织细胞凋亡起作用,自由基可以诱导出血后神经元及胶质细胞凋亡。第二部分脑出血模型中自由基诱导凋亡相关通路的探讨(一)目的:研究脑出血后自由基对于细胞凋亡通路的影响。(二)方法:通过免疫组化半定量检测脑出血后TNF-α的表达,并通过Westernblot检测脑组织中Caspase-3、8的表达及激活,初步探讨了脑出血后自由基相关性凋亡的信号转导途径。(三)结果:1、出血后脑组织血肿周边组织、大脑皮层、海马等区域TNF-α表达及分泌均较假手术明显升高,差异具有显著性,模型组和药物干预组表达水平有差异,可认为自由基与TNF-α水平具有相关性,自由基可以诱导TNF-α表达。2、半定量检测Caspase-3、Caspase-8蛋白水平,脑出血后二者均有激活,总体水平模型组和两种剂量药物干预组较假手术高,模型组表达量高于药物干预组。(四)结论:脑出血后自由基可能对于TNF-α表达及分泌具有诱导作用,Caspase-3、Caspase-8蛋白表达水平升高,认为死亡受体通路可能参与脑出血后细胞凋亡,并与自由基水平相关。