论文部分内容阅读
柔茎香茶菜甲素(以下称化合物FA)是本课题组从冬凌草中分离得到的全新结构对映贝壳杉烯型二萜,以其为先导化合物,课题组前期合成了多个系列的衍生物。化合物YH-12为化合物FA的14位烟酸酯化衍生物,体外抗肿瘤活性高,具有良好的研究开发价值。本论文应用定量蛋白质组学对YH-12的抗肿瘤作用机制开展了研究探索,并对得到的结论进行了生物学验证,具体内容如下:一、采用SRB法测定化合物YH-12对八种常见人源肿瘤细胞株的抗增殖活性,结果表明:YH-12对这八种细胞均具有良好的抑制活性,其中对人食管癌细胞Eca109的作用最强(IC50=0.205μM),并具有浓度和时间依赖性。二、通过TMT联用nanoLC-MS/MS进行了化合物YH-12的定量蛋白质组学研究,实验方法:4μM化合物YH-12/DMSO分别培养Eca109细胞36 h,对细胞裂解物酶解的肽进行TMT 6 plex标记,通过高pH反相色谱法将样品预分级分离成24个级分。Easy-nLC1000联合Q Exactive进行nanoLC-MS/MS检测,MaxQuant搜库。经过统计学分析,鉴定到7431个蛋白,其中可定量蛋白质数量为 6619 个;显著差异蛋白 654 个(fold change≥1.3 或≤0.77,p-value<0.05),其中上调蛋白333个,下调蛋白321个。三、GO功能注释、KEGG信号通路富集和网络通路绘制运用DAVID网站、Cytoscape软件等对蛋白质组学数据进行分析,结果如下:YH-12在肿瘤细胞中的作用途径主要涉及代谢途径、N-聚糖生物合成、溶酶体、囊泡运输中的SNARE相互作用、缬氨酸,亮氨酸和异亮氨酸的降解、脂肪酸代谢、过氧化物酶体、蛋白质输出、脂肪酸伸长率、内质网中的蛋白质加工、甘油脂代谢、核糖体、范可尼贫血途径、细胞周期、p53信号通路、嘧啶代谢、嘌呤代谢等途径。四、对组学结果进行了生物学验证,结果如下:细胞周期分析表明YH-12诱导Eca109细胞发生G2/M期阻滞;细胞凋亡分析表明YH-12诱导Eca109产生浓度依赖性凋亡;通过对KEGG通路的分析表明YH-12对细胞周期的调控集中在与G2/M期相关的ATR-Chk1-Cdc25C途径,蛋白质印迹实验证明ATR、Chk1及Cdc25C蛋白表达量在YH-12处理后均显著下调,与蛋白质组学数据结果一致。总之,论文测试了对映贝壳杉烯类化合物YH-12的体外抗肿瘤活性,应用TMT标记的定量蛋白质组学方法对它的抗肿瘤机制进行了探索性研究,发现了其发生作用的多个靶点和通路,利用蛋白质组学技术首次发现本类化合物的抗增殖活性与ATR、Chk1及Cdc25C蛋白相关并进行了生物学验证。论文的研究结果可为进一步研究本类化合物的抗肿瘤机制及其作用靶点的发现提供有力线索和思路。