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前言：
原发性高血压(Essential Hypertension,EH)是一种严重威胁人们生活质量的多基因复杂疾病,同时也是心血管疾病、脑血管疾病以及肾脏疾病发生的独立危险因素。作为一种常见复杂疾病,原发性高血压的发生发展受到遗传因素与环境因素的共同调控。近年来很多报道表明氧化应激在高血压的发生发展中起到了重要的作用。氧化应激由体内活性氧簇(Reactive oxygen species,ROS)增多或者抗氧化酶活性的降低所致。在心血管系统中最主要的抗氧化酶是胞外超氧化物歧化酶(Extracellular superoxide dismutase,EC-SOD,或SOD3),其可以催化超氧阴离子(·O2-)形成过氧化氢(H2O2)。心血管系统中另一重要的氧化应激相关因子是内皮一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS,或NOS3),其对于血压的调节具有双重作用:一方面,NOS3通过产生NO,舒张血管,降低血压;另一方面,当缺少底物L-精氨酸或辅因子四氢叶酸时,解偶联的NOS3可以产生·O2-,后者又可氧化NO,形成过氧化亚硝酸盐(ONOO-),继而起到促高血压作用。以往关于SOD3基因和NOS3基因多态性与高血压的关联研究报道结果不一,为明确这两个氧化应激相关基因在高血压发生发展中的作用,我们在中国东北汉族人群中对这两个基因进行了关联研究,并进行了初步的功能鉴定。
材料与方法
一、研究对象
研究对象分为两部分:临床样本共计80人(高血压54人,健康对照26人),来自盛京医院循环内科;病例.对照人群共计553人,其中高血压组298人(男124人,女165人),健康对照组264人(男103人,女161人),来自辽宁省彰武县高血压病高发区汉族人群。
二、实验方法
1、应用Flexigene DNA提取试剂盒提取基凶组DNA,检测OD260/280,确定基因组DNA浓度和纯度。
2、采用Real-time PCR技术,检测SOD3基因c.172G＞A(p.Ala58Thr,rs2536512)和NOS3基因c.894G＞T(p.Glu298Asp,m1799983)多态位点的基因型。
3、应用南京建成生物工程有限公司商品化试剂盒检测血浆总SOD活性和NO浓度。
4、所有统计学运算由SPSS13.0 for windows软件完成,临床计量资料以均值±标准差表示;计数资料的关联分析和Hardy-Weinberg平衡检验用x2-检验;两组间计量资料比较使用独立样本t-检验,三组间比较使用One-wayANOVA:基因型与高血压之间的相对危险度用优势比(Odds ratio,OR)表示;P＜0.05被认为具有统计学差异。
结果：
1、临床样本中EH组与对照组间性别和年龄分布无统计学差异。除收缩压(Systolic Blood Pressure,SBP)和舒张压(Diastolic Blood Pressure,DBP)外,血清甘油三酯(Serum triglyeeride,TG)和低密度胆固醇(Low-density LipoproteinCholesterol,LDL-chol)在EH组中显著升高(P＜0.05);而高密度胆固醇(High-densityLipoprotein Cholesterol,HDL-chol)在EH组明显低于正常对照组(P＜0.05)。此外,血清总胆固醇(Total cholesterol,T-chol)、血糖(Glucose,Glu)、尿素氮(UreaNitrogen,BUN)和肌酐(Creatinine,CREA)在EH组和对照组中分布没有明显差异(P＞0.05)。
2、临床样本中SOD3基因c.172G＞A多态性基因型和等位基因的分布符合Hardy-Weinberg平衡。GG纯合子SOD活性明显低于GA杂合子(P=0.042)以及A等位基因携带者(P=0.031)。按性别分组发现,男性C.172G＞A多态性与SOD活性相关(P=0.002),男性GG纯合子SOD活性明显低于GA杂合子(P=0.002)以及A等位基因携带者(P=0.003);而女性G等位基因携带者SOD活性显著低于AA纯合子(P=0.034)。此外,临床样本SOD3基因c.172G＞A态性等位基因和基因型的分布存EH组和对照组中存在显著性筹异。G等位基冈在EH组中的频率明显高于对照组(P=0.021);EH组GG纯合子频率明显高于对照组(OR=0.196,95％CI:0.045-0.861,P=0.020)。Logistic回归分析显示,调整高血压相关因素,包括血清TG、HDL-chol和LDL-chol后,GG基因型仍为EH发生的独立危险因素(OR=6.247,95％CI,1.242-31.432,P=0.026)。
3、临床样本中NOS3基因c.894G＞T多态性基因型和等位基因的分布符合Hardy-Weinberg平衡。在总体人群中,c.894G＞T多态与NO浓度相关(P=0.015),GG纯合子NO浓度(129.66±59.15μmol/L)显著低于GT杂合子(176.10±54.84μmol/L,P=0.005),以及T等位基因携带者(GT+TT,169.84±55.18μmol/L,P=0.010)。按性别分组发现,男性c.894G＞T多态与NO浓度相关(P=0.014),GG纯合子NO浓度(138.79±53.536μmol/L)显著低于GT杂合子(211.01±39.03μmol/L,P=0.004),以及T等位基因携带者(GT+TT,199.43±46.99μmol/L,P=0.010):而在女性中未见c.894G＞T多态性与NO浓度存在关联。此外,临床样本中NOS3基因c.894G＞T多态性基因型频率和等位基因频率在EH组和对照组中的分布无显著性差异。
4、病例一对照人群中,EH组与对照组的性别和年龄分布无统计学差异。EH组中除SBP、DBP和MAP明显高于对照组外,BMI、血清T-chol、TG、LDL-chol、血钙和血钠也高于对照组;而EH组HDL-chol水平则明显低于对照组。
5、病例一对照人群中c.172G＞A多态性基因型频率和等位基因频率分布符合Hardy-Weinberg平衡。关联分析结果未见SOD3基因c.172G＞A多态性基因型和等位基因EH存在关联。方差分析结果显示,不同c.172G＞A基因型携带者血清HDL-chol水平存在显著差异(P=0.022),GG纯合子HDL-chol水平(1.66±0.53mmol/L)显著高于GA杂合子(1.57±0.36 mmol/L,P=0.022)。此外,GG纯合子血清铁离子水平(17.70±7.56μmol/L)明显高于GA杂合子和AA纯合子(16.16±7.56μmol/L,P=0.017)。按性别分组后结果显示,在男性中c.172G＞A多态性GG纯合子HDL-chol水、F(1.67±0.51mmol/L)明显高于GA杂合子和AA纯合子(1.54±0.42mmol/L,P=0.042):而在女性中,不同c.172G＞A基因型携带者血清铁离子水平差异明显(P=0.004),GG纯合子血清铁(16.37±6.25 mmol/L)明显高于GA杂合子(13.95±5.82 mmol/L,P=0.000)。
6、病例.对照人群中NOS3基因c.894G＞T多态性基因型和等位基因分布符合Hardy-Weinberg平衡。C.894G＞T多态性等位基因和基因型在EH组和对照组间分布无显著性差异。对c.894G＞T多态性与血压和相关指标进行分析,结果未见明显相关性。
7、SOD3基因c.172G＞A多态性和NOS3基因c.894G＞T多态性不同组合与原发性高血压的关联分析结果显示,在临床样本中,同时携带SOD3基因GG基因型与NOS3基因GG基因型的个体在高血压中的频率明显高于对照组(P=0.028):而同时携带SOD3基因GA或AA基因型与NOS3基因GG基因型构成的个体在高血压中的频率却显著性低于对照组(P=0.025)。在病例-对照人群中不同基因型组合与高血压之间未见明显相关。
结论：
1、SOD3基因c.172G＞A多态性可能与男性血浆总SOD活性相关,GG纯合子SOD活性明显下降;
2、NOS3基因c.894G＞T多态性可能与男性血浆NO浓度相关,GG纯合子血浆NO浓度显著降低;
3、SOD3基因c.172G＞A多态性和NOS3基因c.894.G＞T多态性可能不是中国东北汉族人群EH发生的主要危险因素。