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天然的以及半合成的糖苷化合物作为药物或者先导化合物已经广泛应用于抗肿瘤医药领域中。糖苷化合物中的糖基对化合物的理化性质和活性都有非常重要的作用。本论文主要研究了一系列以山荷叶素(Diphyllin，DP)为苷元的糖苷类化合物。以往的研究发现DP具有较好的体内外抗肿瘤活性，并且其自然界中存在的某些糖苷在保留了抗肿瘤活性的同时还能降低DP对正常细胞的毒性。对于其作用机理的研究表明该类化合物有诱导细胞凋亡和引起细胞周期阻滞的作用。尽管前期研究解释了该类化合物的一些药理作用机制，但其具体的细胞内作用靶点尚不清楚，也没有进行系统的药效学评价和机制研究。本研究首次阐明了DP及其糖苷衍生物的药理作用与DNA拓扑异构酶的关系，并进一步证实了改造后的DP糖苷增强了DP在体内外的抗肿瘤活性。
首先，对合成的系列DP糖苷化合物进行了较为全面的生物活性评价。应用磺酰罗丹明B蛋白染色法(SRB)评价了该系列化合物对3株肿瘤细胞的体外增殖抑制作用。结果显示部分化合物有较强的细胞毒作用，于是我们对其中活性较强的化合物D8，D11和D15以及苷元DP进行了进一步细胞毒评价，这些化合物均显示出较强的细胞毒活性，对18株肿瘤细胞的平均ICs0值分别为3.16、0.67、0.16和4.24uM，表明改造后部分糖苷化合物的活性显著强于苷元。此外，通过选用两株多药耐药细胞株(K562/A02和KB/VCR)，初步检测了活性较好的糖苷D1，D8，D11和D15对多药耐药细胞的增殖抑制活性。结果表明这些化合物都有一定的抗多药耐药作用，耐药系数明显低于阿霉素(Adriamycin，ADR)、长春新碱(Vincristine，VCR)和依托泊甙(Etoposide，VP16)。接下来我们通过拓扑异构酶II(TopoII)介导的kDNA去连环实验检测了该系列化合物对TopoII的抑制作用，发现细胞毒活性较强的化合物如D1，D11，D13和D15等，对TopoII的抑制活性也较强，呈现出良好的相关性，提示TopoII是该类化合物的主要靶点。另外该系列化合物还能引起HL-60细胞周期阻滞并诱导细胞凋亡。构效关系分析显示糖基部分为6-脱氧吡喃糖的化合物比糖基为普通糖的化合物活性更强。并且吡喃糖基上6-“OH的烷基取代能增强化合物的活性，另外DP糖苷缩醛衍生物的活性显著增强。上述结果表明糖基的修饰对化合物的活性起着非常重要的作用，并且呈现出良好的构效关系。活性较好的DP糖苷具有较强的体外抗肿瘤活性和TopoII抑制活性。
其次，对活性较好的化合物D11进行进一步作用特性研究。由于D11在以上工作中显示出DNA拓扑异构酶II抑制活性。本研究检测了D11对拓扑异构酶I/II活性的影响，并进一步对其可能的作用机制作了探讨。DNA拓扑异构酶I/II介导的pBR322解螺旋实验和TopoII介导的kDNA去连环实验结果表明，D11对拓扑异构酶I无抑制作用，仅对拓扑异构酶IIα的活性有抑制作用，且作用强于母核DP。通过TopoII介导的DNA切割实验发现，D11并不能诱导可切割复合物的形成。但是与传统TopoII催化抑制剂不同的是，D11不能拮抗VP16引起的可切割复合物的形成，以及VP16诱导的DNA彗星拖尾和γ-H2Ax磷酸化的升高，提示D11可能并不作用于TopoII催化循环中可切割复合物形成之前的催化环节。这些结果表明D11是一个全新结构类型的拓扑异构酶II的催化抑制剂。
为了进一步阐明D11作用于TopoIIγ的机制和特点，我们检查了D11对TopoII催化循环中各个步骤的影响。因为DNA嵌入剂也可以影响拓扑酶的活性，因此首先需要检测D11是否是一个DNA嵌入剂。通过DNA伸展实验和EB替代分析我们发现D11是一个DNA非嵌入剂。凝胶电泳迁移实验也表明D11不能阻碍TopoII和HDNA的结合。对于链转移前和转移后TopoII介导的DNA链的切割和切割后的DNA链的再连接，D11也没有作用。通过酶联法检测在药物存在的情况下，TopoIIαATPase对ATP的水解活性，发现D11可以抑制ATP的水解，并且可以与ATP竞争性的抑制ATP的水解以及TopoII介导的kDNA去连环。表面等离子共振(SPR)分析表明D11可以直接与TopoIIaATPase域结合，KD值为3.22E-05，高于ATP与ATP口袋的结合常数。虚拟模拟分析显示这种结合可能影响ATP与TopoIIα的结合，并且D11的糖基部分能与ATP口袋部位形成更多氢建，所以其结合活性强于母核DP。因此我们发现D11能够抑制TopoIIα活生和ATP的水解，其分子机制可能在于D11能够竞争ATP结合于TopoIIα的ATPase结构域，从而影响酶的活性。
在明确了D11对TopoII的具体作用方式后，我们应用RNA干扰(RNAi)的方法下调TopoIIα的表达，发现干扰后能够降低D11诱导的Sw1116细胞的凋亡和增殖，表明TopoIIα是D11在细胞内的一个主要靶点。最后，我们对D11的体内抗肿瘤活性进行了评价，进行糖基修饰后，D11相对于DP的体内外抗肿瘤活性显著提高，T/C值为42.57％，而相同剂量下DP的T/C值为70.66％，并且D11也能够诱导细胞凋亡，除引起细胞的G2期阻滞外，还能引起细胞G1期阻滞和相关周期蛋白的变化。
综合上述，本研究初步评价了DP及其糖苷类化合物的生物学活性并阐明了其构效关系，确认了D11的体外抗肿瘤活性，并进一步证实D11是一个新的DNA非嵌入型TopoII催化抑制剂，它能够抑制TopoII介导的ATP的水解。其分子机制在于D11能够竞争ATP结合于TopoIIα的ATPase结构域。