论文部分内容阅读
分枝杆菌是一种革兰氏阳性抗酸杆菌，许多为环境中常在菌。大多数菌株生长缓慢，有些能够引起人和动物结核及结核样疾病，这一类分枝杆菌组成了结核分枝杆菌复合群，该菌有许多共同的抗原蛋白。MPB64蛋白是结核分枝杆菌复合群成员都合成分泌的一种早期滤液蛋白，是该复合群特异性的分泌蛋白，在菌株鉴定和疫苗研究中都有重要应用。本实验为了制备MPB64单克隆抗体，根据Genbank中已发布的Mycobacterium bovis AF2122／97菌株的mpb64基因序列设计引物，以牛分枝杆菌ValleeⅢ菌株基因组DNA为模板，PCR扩增出具有完整开放阅读框架(ORF)的mpb64基因，连接到pET32a(+)中构建原核表达载体，诱导表达重组蛋白(rMPB64)。同时，将mpb64基因经BamHI和EcoRI双酶切后连接到真核表达质粒pcDNA3.1(+)中，构建真核表达质粒pc-mpb64，经瞬时转染鉴定该真核质粒能够在哺乳动物细胞SP2／0中表达。以构建的真核表达质粒免疫BABL／c小鼠，采用聚乙二醇PEG介导脾细胞和SP2／0骨髓瘤细胞融合，用纯化的rMPB64来筛选针对MPB64蛋白的单克隆抗体，阳性的细胞株用有限稀释法进行3～4次亚克隆，最终获得3株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为A2E5、B3G8和C5F10。对单克隆抗体亚型鉴定结果表明：A2E5为IgM亚型，轻链为λ链；B3G8和C5F10为IgG2a亚型，轻链为κ链。ELISA试验证实，3株单抗都能与纯化的rMPB64以及纯化的牛分枝杆菌培养滤液蛋白(PPD)反应，与本实验室表达并纯化的rMPB70-83-ESAT6不反应。Western blot分析表明，3株单抗都不能与经SDS-PAGE变性电泳后转移到NC膜上的rMPB64发生反应，认为制备的单克隆抗体识别的可能是MPB64蛋白的构象表位。本实验利用大肠杆菌原核表达系统成功表达和纯化了重组蛋白rMPB64，并以此蛋白为筛选抗原，采用基因免疫的方法制备了3株能够分泌针对MPB64蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞，这为进一步研究MPB64蛋白的结构和功能，以及建立MPB64蛋白的检测方法奠定了基础。