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目的:利用Crisper cas9技术及转基因小鼠模型,获得干细胞上YAP1敲除条件转基因小鼠。通过对YAP1敲除转基因小鼠发育成熟时前列腺的研究,探讨YAP1通过调控正常前列腺干细胞维持干性及分化进而影响前列腺正常生长发育的分子机制。一方面,进一步了解正常前列腺生长发育分子机制,可能在未来为前列腺癌的防治提供新的方向;另一方面,进一步探讨YAP1蛋白的分子功能,为将来YAP1可能作为一个肿瘤防治的新靶点提供证据。方法:实验主要为体内实验。我们选用CD133作为胚胎时期干细胞的标志物。CD133作为干细胞标记物,在胚胎及成人时期中枢神经系统、肾、肠、泌尿生殖系统包括前列腺等都有表达。我们使用Cre-loxp系统及Crisper cas9技术获得干细胞上YAP1敲除转基因小鼠。通过杂交得到基因型为YAP1fl/fl,CD133-Cre ERT2的转基因小鼠,进而达到时间及组织特异性的YAP1敲除效果。我们在胚胎第17天(小鼠前列腺发育开始于妊娠17.5天)给予与雄性基因型为YAP1fl/fl杂交的基因型为YAP1fl/fl,CD133-Cre ERT2的妊娠母鼠Tamoxifen,即在小鼠前列腺发生时期诱导小鼠干细胞上YAP1的敲除并行同窝对照,予出生后6周收获小鼠前列腺组织,进而得到YAP1敲除转基因小鼠发育阶段前列腺。将收获的前列腺组织常规固定、脱水包埋为蜡块,并制成石蜡切片以行下一步研究。行HE染色,观察对比两组前列腺组织形态学有无差异及差异所在;行YAP1免疫组化染色,检验YAP1敲除效率;行免疫组化染色检测前列腺细胞标志物及增殖凋亡情况,并检测正常前列腺发育指标蛋白的表达;另取6周小鼠前列腺,分叶分离并称重,经胶原酶消化后,在显微解剖镜下分离前列腺导管分支,并计数分支点及导管末梢数,了解前列腺导管生长发育。结果:1.通过选择不同的杂交方案,得到基因型为YAP1fl/fl,CD133-Cre ERT2的实验组雄性小鼠及基因型为YAP1fl/fl的同窝对照组小鼠,进而收获实验组与对照组小鼠前列腺;实验组小鼠前列腺免疫组化示YAP1表达较对照组明显减少,且减少区域呈片状分布,证实转基因小鼠构建成功;2.对前列腺大体标本检测后发现,实验组小鼠前列腺大小及重量小于对照组,且其分支及导管末梢数明显小于对照组小鼠;进一步行HE染色示:导管数目减少,导管中folding减少,前列腺腺泡皱缩,发生成熟障碍;证实YAP1敲除小鼠的前列腺发育受到抑制;3.实验组小鼠前列腺标本行Ki67染色及Tunel凋亡实验证实YAP1敲除使发育前列腺增殖减少,凋亡增加。行AR免疫组化示YAP1敲除导致AR表达下降,说明YAP1可能调控AR相关通路,敲除YAP1使AR表达减少,前列腺组织增殖减少,凋亡增加,进而表现出发育受抑表型,但仍需更多实验证实两者间相关性。结论:1.成功构建时间特异性、组织特异性YAP1转基因敲除小鼠模型YAPfl/fl-CD133-Cre ERT,可以在特定时间诱导CD133标记的干细胞上敲除YAP1基因。2.敲除YAP1后,影响了前列腺干细胞的功能,使其自我增殖及分化成熟的功能受到抑制,进而影响了前列腺腺泡的成熟,使芽生阶段的新生导管发育延缓,形成成熟障碍。小鼠前列腺组织生长发育明显受到抑制,腺体成熟障碍,且增殖减少,凋亡增多。3.敲除YAP1后,小鼠前列腺组织AR表达水平下降,YAP1可能通过调控AR相关通路进而影响前列腺生长发育,机制仍需进一步研究。