论文部分内容阅读
试验目的探讨大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）的分离、培养及表型鉴定方法。研究单独或共同应用TGF-β1和IGF-1基因转染大鼠BMSCs后,比较目的基因的分泌情况及向软骨细胞分化效果,为构建新型组织工程软骨种子细胞提供新思路。试验方法扩增、提取质粒pcDNA3.1-IGF-1、pcDNA3.1-TGF-β1,酶切、电泳鉴定并测序。将密度梯度离心法和贴壁分离法相结合,分离、纯化Wistar大鼠BMSCs,倒置相差显微镜观察原代和传代BMSCs的形态学改变,免疫荧光法检测细胞表面标志。将TGF-β1和IGF-1基因单独和共转染BMSCs,按转染情况分为5组:未转染组（A组）、转染空载体组（B组）、转染TGF-β1组（C组）、转染IGF-1组（D组）、TGF-β1加IGF-1共转染组（E组）。对转染后细胞进行筛选,MTT法测定筛选后细胞的增殖活性,RT-PCR和Western blot法检测筛选后细胞的表达。结果电泳显示IGF-1和TGF-β1两目的基因条带,基因测序与GenBank cDNA序列相符。大鼠BMSCs原代细胞接种24 h后可见少量贴壁突起细胞,4、5 d开始形成典型的BMSCs簇状增生灶,9、10 d细胞生长即可达80%～90%融合。传代后细胞的形态比较均一。转染24 h后有少量细胞死亡,筛选3周后细胞细胞克隆形成,至第4周时细胞可进行传代,多数细胞变成多边形,部分细胞边界不清,呈圆形,核偏位,核周颗粒明显。免疫荧光法检测BMSCs的CD29、CD44呈阳性反应,CD34、CD45呈阴性反应。MTT法测定各组细胞在490 nm波长处的A值,分别为:A组0.432±0.038、B组0.428±0.041、C组0.664±0.086、D组0.655±0.045E组0.833±0.103。A、B组与C、D、E组间差异有统计学意义（P＜0.01）,A、B组间和C、D、E组间差异无统计学意义（P＞0.05）。RT-PCR和Western blot检测目的基因和蛋白的表达量,TGF-β1表达以C组最多,分别为0.9250±0.0220、124.3417±2.9820,E组次之,分别为0.7717±0.012 0、101.7667±1.2410（P＜0.01）;IGF-1的表达以E组最多,分别为1.0200±0.0260、128.1717±9.1520,D组次之,分别为0.4650±0.0420、111.0450±6.2480（P＜0.01）;Ⅱ型胶原的表达以E组最多,分别为0.9800±0.0340、120.3550±12.5500,C组次之,分别为0.7200±0.0260、72.2467±7.3640（P＜0.01）。结论以脂质体介导法能将TGF-β1和IGF-1目的基因导入MSCs建立稳定表达,转染后MSCs在自身分泌合成的TGF-β1和IGF-1作用下,软骨细胞外特异性基质蛋白CollagenⅡ增多,同时MSCs细胞增殖代谢活力明显增强,提示TGF-β1基因修饰MSCs可以作为软骨组织工程种子细胞。