[研究背景] 肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae，K.pneumoniae)为革兰阴性菌，属于肠杆菌科克雷伯菌属，其广泛分布于自然界，是人类呼吸道和肠道的常居菌，常导致呼吸道、泌尿道、消化道和皮肤软组织感染及败血症等，近年来已成为仅次于大肠杆菌的最重要的条件致病菌之一，在医院获得性感染中占有非常重要的地位。 随着抗生素在临床上的广泛使用，肺炎克雷伯菌对抗生素的耐药状况日趋严重，由耐药菌株导致的医院感染发生率逐年上升。β-内酰胺类抗生素是治疗肺炎克雷伯菌感染的有效药物，然而随着β-内酰胺类抗生素尤其是第三代头孢菌素在临床上的大量应用，肺炎克雷伯菌对其耐药性也逐年提高，给临床抗感染治疗带来了极大挑战。 产超广谱β-内酰胺酶(extended-spectrumβ-lactamase，ESBLs)是肺炎克雷伯杆菌对β-内酰胺类抗生素耐药的主要机制之一。ESBLs是细菌产生的能水解大多数青霉素、头孢菌素和氨曲南等β-内酰胺类抗生素且活性能被酶抑制剂(如克拉维酸、舒巴坦、三唑巴坦)抑制的一类β-内酰胺酶。ESBLs主要由质粒介导，易在同种属或不同种属细菌之间水平传播引起产酶菌医院感染的暴发流行，而且产ESBLs细菌的质粒常常携带氨基糖甙类、氯霉素或磺胺类抗生素耐药基因，使产ESBLs菌株呈现多重耐药性，进一步加大了临床治疗的难度。由于不同国家和地区的抗感染治疗策略不同，临床抗生素的使用管理亦有差别，常导致不同地区产ESBLs肺炎克雷伯菌流行的基因型和耐药性也存在差异。因此，了解本地区甚至本院产ESBLs肺炎克雷伯菌对常见抗生素的耐药性及耐药谱特征，在基因水平上检测ESBLs的编码基因，分析ESBLs在肺炎克雷伯菌中的流行基因型，可以有效指导临床抗生素的合理使用，并对预防和控制肺炎克雷伯菌耐药菌株的传播和流行也具有非常重要的意义。 [目的] 1.了解中山大学附属第三医院临床分离的肺炎克雷伯菌中ESBLs的流行情况及其对常见抗生素的耐药谱特征，以指导临床合理选用抗生素。 2.采用PCR法对肺炎克雷伯菌携带的ESBLs耐药基因进行初步分型，并对部分产ESBLs菌株进行DNA测序以确定其基因亚型，了解中山大学附属第三医院产ESBLs肺炎克雷伯菌的分子流行病学特征。 [材料与方法] 1、产ESBLs肺炎克雷伯菌流行状况及耐药性 1.1受试菌株：2007年1月至12月中山大学附属第三医院临床分离的非重复肺炎克雷伯菌107株。 1.2ESBLs的表型筛选与确证试验：采用CLSIMS100-15文件(2005年版)推荐的ESBLs的表型筛选与确证试验。 1.3药物敏感性试验：采用K-B(Kirby-Bauer)纸片法检测107株临床分离肺炎克雷伯菌对20种常见抗生素的敏感性，按CLSIMS100-15文件(2005年版)标准判断结果。 1.4统计分析：采用办公软件MicrosoftExcel2003和统计学软件SPSS13.0对肺炎克雷伯菌的药敏试验结果进行统计分析，产ESBLs菌与非产ESBLs菌株敏感率之间的比较应用X2检验，P<0.05有统计学意义。 2、产ESBLs肺炎克雷伯菌的分子流行病学研究 2.1受试菌株：ESBLs表型确证试验阳性的肺炎克雷伯菌共46株。标准菌株：TEM-3、SHV-18、CTX-M-3、CTX-M-5、CTX-M-8等产ESBLs标准菌株。 2.2DNA模板的制备：采用煮沸裂解法制备DNA模板。 2.3引物设计：参照文献设计5组常见的ESBLs基因引物：TEM型及SHV型通用引物各一组；CTX-M型设计3组引物，分别为CTX-M-Ga包括CTX-M-8、9、13、14、16~19及Toho-2亚型：CTX-M-Gb包括CTX-M-2、4~7及Toho-1亚型；CTX-M-Gc包括CTX-M-1、3、10~12、15亚型。 2.4PCR扩增：ESBLs基因经PCR扩增，产物采用琼脂糖凝胶电泳法，在含0.5μg/ml溴乙啶的1.5％琼脂糖凝胶中电泳，用凝胶成像系统观察结果并照相。 2.5DNA测序分析：从PCR产物扩增阳性组中每组随机挑选6株送测序公司切胶回收纯化及测序，结果与GenBank提供的ESBLs基因核苷酸序列进行对比以确定其基因亚型。 [结果] 1.肺炎克雷伯菌中ESBLs产生率为43.0％(46/107)。 2.药敏试验结果显示：①46株产ESBLs肺炎克雷伯菌对亚胺培南敏感率最高，为100％，其次为阿米卡星、哌拉西林/三唑巴坦，敏感率分别为82.6％、80.4％，产ESBLs肺炎克雷伯菌对其余17种抗生素敏感率均<60‰②61株非产ESBLs肺炎克雷伯菌对氨苄西林、哌拉西林敏感率较低，为6.6％、55.7％；对甲氧苄啶/磺胺甲嗯唑敏感率为59.0％；其余17种抗生素对非产ESBLs肺炎克雷伯菌有较好的体外抗菌活性，敏感率为63.2％～96.7％。③产ESBLs肺炎克雷伯菌和非产ESBLs肺炎克雷伯菌对20种常见抗生素的敏感率比较结果显示，除亚胺培南、阿米卡星、哌拉西林/三唑巴坦外，产ESBLs菌株对其他β-内酰胺类抗生素的敏感率均显著低于非产ESBLs菌株(P<0.05)。 3.46株产ESBLs肺炎克雷伯菌PCR扩增结果显示，43株(93.5％)产CTX-M型ESBLs其中CTX-M-Ga组阳性37株(80.4％)，CTX-M-Gb组未扩增出阳性条带，CTX-M-Gc组阳性9株(19.6％)；11株(23.9％)产TEM型β-内酰胺酶，13株(28.3％)产生SHV型β-内酰胺酶。23株(50.0％)携带2种或2种以上β-内酰胺酶基因型。 4.随机抽取样本测序结果显示，CTX-M型中有CTX-M-15、CTX-M-24、CTX-M-38ESBLs基因型，SHV型组中有SHV-11、SHV-12、SHV-28β-内酰胺酶基因型，TEM型组检出TEM-1型广谱酶。 [结论] 1.中山大学附属第三医院产ESBLs肺炎克雷伯菌产生率高，ESBLs在本院肺炎克雷伯菌中已广泛流行。产ESBLs肺炎克雷伯菌呈多重耐药，对亚胺培南敏感率最高；产ESBLs菌株对抗生素的敏感率比非产ESBLs菌株的敏感率显著降低。 2.产ESBLs肺炎克雷伯菌的基因型以CTX-M型为主，部分菌株同时产两种或两种以上β-内酰胺酶基因型，产ESBLs肺炎克雷伯菌的基因型已经出现多样化的特征。中山大学附属第三医院肺炎克雷伯菌存在SHV-12、CTX-M15、CTX-M24、CTX-M-38等ESBLs基因亚型和TEM-1、SHV-11、SHV28广谱β-内酰胺酶的基因流行。