本论文研究工作为陕西省重点研发项目重点产业创新链（群）—社会发展领域资助项目——“基于功效物质分布规律的中药复方配伍理论与应用技术示范性研究”的主要内容。本论文研究对象为复方中成药气血和胶囊,具疏肝理气、活血化瘀、止痛等功效,临床上主要用于气滞血瘀型月经不调诸症,但目前其功效物质及作用机制不明,而且质控指标单一,极大程度上限制了其临床合理应用和产品升级优化,因此本研究基于整合效应和质量标志物,对气血和胶囊开展功效评价、药效物质基础及作用机制、质量标志物、处方精简、成分配伍系统研究,为气血和胶囊产品升级优化提供科学证据,同时为中药复方的配伍优化研究提供方法学参考。论文共分为五章,具体研究内容如下:第一章文献研究第一节基于网络药理学的中药及复方研究进展中医药作为一种补充和替代医学,在我国及周边国家已被广泛实践和发展,具有显著的临床疗效。中药作为中医防治疾病的主要物质手段,因此对中药及中药复方的复杂化学成分和作用机制进行系统的分析和阐明将有助于推进中医药现代化的发展进程。如今,随着网络药理学的广泛应用,通过构建“中药-成分-靶标-疾病-症候”的关系,在一定程度上揭开了中医药的神秘面纱,并且促进了药物发现、医学指导和中医证候剖析等方面发展。此外,随着计算技术向网络药理学的融入,数据挖掘的效率和准确性,活性化学成分的识别以及作用靶标蛋白的预测得到了空前的提高和改善,而且“中药-成分-靶标-疾病-症候”网络关系得到更加系统、全面的解释。因此,全面综述计算技术在中医药网络药理学研究中各个方面的应用很有必要。本章系统剖析中医药计算网络药理学所涉及的核心内容,并结合前沿研究实例,比较分析不同计算技术的优缺点,为中药及中药复方的计算网络药理学研究提供思路与方法。第二节研究思路与方案设计本节旨在说明课题研究思路、论文设计以及研究内容的整体框架。围绕气血和胶囊,通过复制大鼠气滞血瘀证病理模型,拟解决以下关键问题:（1）系统阐明气血和胶囊的药效物质基础及量-效关系;（2）量化辨识确认气血和胶囊的质量标志物;（3）优选得到气血和胶囊精简处方以及配伍组分;（4）初步探究气血和胶囊治疗气滞血瘀证的作用机制。第二章基于气滞血瘀证的气血和胶囊功效物质基础与作用机制研究第一节气血和胶囊治疗气滞血瘀证的效应评价研究采用长期皮下注射小剂量肾上腺素并加慢性不可预见性刺激复制大鼠气滞血瘀证模型,分别设置正常组、气滞血瘀证模型组、气血和胶囊临床等效量、临床3倍量、临床6倍量给药组以及复方丹参滴丸组,通过血液流变学（WBV、PV）、凝血四项（PT、APTT、TT、FIB）相关指标,结合主成分分析（PCA）和正交/偏最小二乘法-判别（OPLS-DA/PLS-DA）分析来评价气血和胶囊治疗气滞血瘀证活血化瘀的效应,结果表明气血和胶囊各剂量组均具有显著活血化瘀效应,以气血和胶囊临床等效剂量的活血化瘀效应最强,本研究为气血和胶囊的临床合理应用提供了依据。第二节基于网络药理学的气血和胶囊治疗气滞血瘀证物质基础及作用机制研究本研究通过网络药理学研究气血和胶囊治疗气滞血瘀证的活性成分和作用机制。借助TCMSP、TCM-MESH等数据库结合文献挖掘的方法,以OB≥30%、DL≥0.18和Caco-2≥-0.4作为活性成分筛选标准。基于TCMSP、TCM-MESH、CTD等数据库预测活性成分的靶标,并通过Uniprot和Gene Cards数据库根据靶标分子功能将靶标归属到气滞血瘀证的相应病理过程中。采用Cytoscape构建“药物-成分-靶标-病理过程”网络,然后对各网络模块靶标进行GO富集和通路分析。气血和胶囊中185个活性成分作用于51个靶标蛋白涉及调控血液流变学异常;184个活性成分作用于68个靶标蛋白涉及改善凝血功能异常;174个活性成分作用于24个靶标蛋白涉及改善疼痛;191个活性成分作用于29个靶标蛋白涉及参与炎症;105个活性成分作用于27个靶标蛋白涉及调节免疫。气血和胶囊通过同时改善血液流变学异常、凝血功能异常、疼痛、炎症及免疫来治疗气滞血瘀证。该研究系统的揭示了气血和胶囊治疗气滞血瘀证的潜在活性成分及机制,同时为药效物质基础和作用机制实验研究提供依据。第三节基于代谢组学的气血和胶囊治疗气滞血瘀证量-效关系与作用机制研究采用长期皮下注射盐酸肾上腺素并加慢性不可预见性刺激复制大鼠气滞血瘀模型,将大鼠分为正常组、模型组、气血和胶囊给药组（0.5倍剂量组、临床等效剂量组、2倍剂量组、3倍剂量组、4倍剂量组、5倍剂量组）,阳性药复方丹参滴丸给药组（CDDP）,通过血液流变学、凝血四项（PT、APTT、TT、FIB）相关指标来评价气血和胶囊活血化瘀的效应,结合多指标综合指数法确定气血和胶囊治疗气滞血瘀证的量-效关系:气血和胶囊临床等效5倍量>气血和胶囊临床等效倍量>气血和胶囊临床等效4倍量>气血和胶囊临床等效1/2倍量>气血和胶囊临床等效2倍量>气血和胶囊临床等效3倍量。应用超高效液相色谱-串联四极杆飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF-MS）技术,对各组大鼠血浆中内源性代谢物进行测定,采用主成分分析（PCA）和正交/偏最小二乘法-判别分析（OPLS-DA/PLS-DA）对血浆中内源性标记物进行多元数据统计分析,并基于SPSS 19.0对潜在的差异代谢物进行P检验。结果表明,PCA得分图中模型组大鼠的代谢轮廓能较好地与其他组分开,进一步从模型组大鼠血浆代谢图谱中定性鉴出Lyso PC（18:0）、Lyso PC（16:0）、PC（16:0/22:6（4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z））、Lyso PC（18:1（9Z））、Lyso PC（20:4（5Z,8Z,11Z,14Z））等代谢物为潜在代谢生物标志,这些内源性物质在其他各给药组大鼠中得到了不同程度的恢复,通过Met Pa通路分析,气滞血瘀证模型主要与甘油磷脂代谢、亚油酸代谢、α-亚麻酸代谢、糖基磷脂酰肌醇（GPI）-锚定生物合成、醚脂质代谢、花生四烯酸代谢、初级胆汁酸的生物合成等7条代谢通路有关。气血和胶囊可回调气滞血瘀证大鼠异常变化的内源性差异代谢物,通过调控上述代谢通路来治疗气滞血瘀证。第三章气血和胶囊的质量标志物研究第一节基于层次分析-熵权法的气血和胶囊质量标志物辨识气血和胶囊是针对引起妇女疾病的常见原因“气血失和”所研制而成的复方中成药,具有疏肝理气、活血化瘀及止痛的功效。由于其组方药味较多（15味）且具多重功效,对产品的质量控制一直是影响其可持续发展的瓶颈问题。因此,我们采用本课题组前期建立的基于层次分析法-熵权法的中药质量标志物量化辨识体系,以气血和胶囊不同功效为切入点,计算整合气血和胶囊化学成分在多重有效性（疏肝理气、活血化瘀和止痛）、可测性及专属性等项目下的评分,同时兼顾复方配伍关系,最终发现阿魏酸、槲皮素、咖啡酸、山柰酚、芦丁、藁本内酯、洋川芎内酯I、香草酸、原儿茶酸、绿原酸、迷迭香酸、洋川芎内酯A、没食子酸、延胡索乙素和丁香酚15种活性成分为气血和胶囊综合评分靠前的质量标志物。研究结果为气血和胶囊质量标准提升及标准化深入研究提供了科学证据,同时也为多功效的中药复方质量标志物量化辨识研究提供了方法学参考。第二节基于质量标志物的气血和胶囊主要成分定量方法研究本研究采用高效液相色谱法建立了同时测定气血和胶囊中5个主要成分的定量研究方法,采用聚类分析分析了市售10批次气血和胶囊中5个成分的规律并建立了气血和胶囊的指纹图谱。采用Waters Sun Fire C18色谱柱（4.6 mm×150 mm,5μm）;以甲醇（A）-0.2%甲酸水（B）为流动相,梯度洗脱;流速1.0 m L·min-1;检测波长280 nm（丹酚酸B、藁本内酯、柚皮苷、新橙皮苷）、235 nm（芍药苷）;柱温30℃;进样量20μL;市售10批次气血和胶囊中5个成分的色谱峰均达到基线分离,芍药苷、柚皮苷、新橙皮苷、丹酚酸B、藁本内酯的线性方程分别为Y=24784X-59263（r=0.9999）、Y=30425X-13282（r=0.9999）、Y=39424X-36032（r=0.9998）、Y=7868.5X-16625（r=0.9999）、Y=21701X-36214（r=0.9999）;平均加样回收率分别为100.53%（RSD=0.68%）、100.09%（RSD=2.01%）、98.82%（RSD=1.72%）、103.19%（RSD=1.03%）、92.43%（RSD=2.08%）;10批气血和胶囊样品中上述5个成分的含量范围2.42～4.93mg·g-1、2.80～3.16mg·g-1、1.28～1.44mg·g-1、2.82～4.54mg·g-1、2.21～3.62mg·g-1;随后基于聚类分析评价10批次气血和胶囊样品中成分含量差异,结果表明气血和胶囊上述5种成分含量差异较小,质量均一。该方法简单、灵敏、可靠、准确,为气血和胶囊的的质量提升研究提供参考。第四章气血和胶囊的处方精简研究第一节基于质量标志物分析的气血和胶囊处方精简效应比较研究基于气血和胶囊质量标志物研究的相关数据,获得气血和胶囊化学成分在其疏肝理气、活血化瘀、止痛功效项的评分,并根据层次分析法-熵权法获得各功效项的比重,综合分析得到气血和胶囊活性成分的综合得分,随后将各活性成分按照来源药材的不同归属到气血和胶囊相应中药中,即获得气血和胶囊组方中各药对效应的贡献得分,删减功效贡献较小的中药,获得气血和胶囊精简处方B（删减桃仁、桔梗、乌药三味药材）和气血和胶囊精简处方C（删减桃仁、桔梗、乌药、牛膝、升麻五味药材）,同前基于大鼠气滞血瘀模型,通过检测血液流变学、凝血四项等指标,评价气血和胶囊各精简方的活血化瘀效应。通过多指标综合指数法综合分析表明自制气血和胶囊原方组、气血和胶囊精简处方B组高剂量与气血和胶囊精简处方C低剂量组具有显著的活血化瘀效应,能明显改善气滞血瘀证大鼠的血液流变学及凝血功能的异常,但是其活血化瘀效应不如气血和胶囊临床等效量组,本研究为气血和胶囊处方精简的深入研究提供参考。第二节基于代谢组学的气血和胶囊精简处方作用机制研究采用长期皮下注射盐酸肾上腺素并加慢性不可预见性刺激复制大鼠气滞血瘀模型,将大鼠分为正常组（C）、模型组（M）、气血和胶囊临床等效给药组（Q）、气血和胶囊原方组（QA）、气血和精简处方B低剂量（QB-L）、气血和精简处方B中剂量（QB-M）、气血和精简处方B高剂量（QB-H）、气血和精简处方C低剂量（QC-L）、气血和精简处方C中剂量（QC-M）、气血和精简处方C高剂量（QC-H）、阳性药复方丹参滴丸给药组（CDDP）,运用超高效液相色谱-串联四极杆飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF-MS）技术,对各组大鼠血浆中内源性代谢物进行测定,采用主成分分析（PCA）和偏最小二乘法-判别分析（OPLS-DA）对血浆中内源性标记物进行多元数据统计分析,并基于SPSS 19.0对潜在的差异代谢物进行P检验。结果表明,PCA中模型组大鼠能较好地与其他组分开,进一步从模型组大鼠血浆代谢图谱中定性鉴出Palmitic acid、Retinyl ester、PE（P-18:0/22:4（7Z,10Z,13Z,16Z））、PC（20:4（8Z,11Z,14Z,17Z）/18:4（6Z,9Z,12Z,15Z））、PC（22:6（4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z）/16:1（9Z））、8,11,14-Eicosatri-enoicacid、Lyso PC（20:5（5Z,8Z,11Z,14Z,17Z））等代谢物为潜在代谢生物标志,这些内源性物质在各给药组大鼠中得到了不同程度的恢复,通过Met Pa通路分析,气滞血瘀证大鼠代谢紊乱主要与不饱和脂肪酸的生物合成、亚油酸代谢、甘油磷脂代谢、α-亚麻酸代谢、脂肪酸生物合成、糖基磷脂酰肌醇（GPI）-锚定生物合成、视黄醇代谢、花生四烯酸代谢、初级胆汁酸的生物合成等12条代谢通路相关。气血和胶囊各精简处方能回调气滞血瘀证大鼠异常变化的内源性差异代谢产物,调节上述代谢通路治疗气滞血瘀证。第五章气血和胶囊的成分配伍研究第一节基于质量标志物分析的气血和胶囊成分配伍效应比较研究基于气血和胶囊质量标志物的研究结果,获得气血和胶囊化学成分在其疏肝理气、活血化瘀、止痛功效项的评分,并根据层次分析法-熵权法获得各功效项的比重,综合分析得到气血和胶囊活性成分分别在疏肝理气、活血化瘀、止痛功效项的综合得分,最终确定阿魏酸为疏肝理气功效代表性成分、丹酚酸B为活血化瘀功效代表性成分、延胡索乙素为止痛功效代表性成分。设置阿魏酸-丹酚酸B-延胡索乙素成分配伍高中低三个剂量给药组,基于前述大鼠气滞血瘀证模型、通过检测血液流变学、凝血四项等指标,评价气血和成分配伍各剂量组的活血化瘀效应,结果表明阿魏酸-丹酚酸B-延胡索乙素成分配伍的活血化瘀效应呈剂量依赖性:高剂量>中剂量>气血和胶囊临床等效剂量>低剂量。第二节基于代谢组学的气血和胶囊成分配伍作用机制研究采用长期皮下注射盐酸肾上腺素并加慢性不可预见性刺激复制大鼠气滞血瘀模型,将大鼠分为正常组（C）、模型组（M）、气血和胶囊临床等效给药组（QXH）、阿魏酸-丹酚酸B-延胡索乙素配伍组低剂量（TSF-L）、阿魏酸-丹酚酸B-延胡索乙素配伍组中剂量（TSF-M）、阿魏酸-丹酚酸B-延胡索乙素配伍组高剂量（TSF-H）、阳性药复方丹参滴丸给药组（CDDP）,运用超高效液相色谱-串联四极杆飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF-MS）技术,对各组大鼠血浆中内源性代谢物进行测定,采用主成分分析（PCA）和偏最小二乘法-判别分析（OPLS-DA）对血浆中内源性标记物进行多元数据统计分析,并基于SPSS 19.0对潜在的差异代谢物进行P检验。结果表明,PCA中模型组大鼠能较好地与其他组分开,进一步从模型组大鼠血浆代谢图谱中定性鉴出Lyso PC（18:0）、PC（18:0/16:1（9Z））、Lyso PC（18:2（9Z,12Z））、PC（20:4（5Z,8Z,11Z,14Z）/18:0）、Lyso PC（20:3（5Z,8Z,11Z））等代谢物为潜在代谢生物标志,这些内源性物质在各给药组大鼠中得到了不同程度的恢复,通过独特路分析,气滞血瘀证大鼠代谢紊乱主要与亚油酸代谢、甘油磷脂代谢、牛磺酸代谢、α-亚麻酸代谢、糖基磷脂酰肌醇（GPI）-锚定生物合成、花生四烯酸代谢、不饱和脂肪酸的生物合成、酪氨酸代谢、初级胆汁酸的生物合成等9条代谢通路相关。阿魏酸-丹酚酸-B-延胡索乙素组分配伍能调回气滞血瘀证大鼠异常变化的内源性差异代谢产物,调节上述代谢通路治疗气滞血瘀证。