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Scygonadin是近年来从拟穴青蟹精浆中分离获得的一种新的阴离子抗菌肽,具有抗菌功能。该抗菌肽在水产养殖业具有重要的潜在应用价值。本项研究拟以Scygonadin的基因工程表达产物口服海水养殖鱼类黑鲷,观察该抗菌肽进入鱼体内后对免疫相关因子的影响及其消化吸收规律,为将来科学应用抗菌肽提供理论依据。主要研究成果如下: 1、重组Scygonadin基因工程产物灌胃黑鲷免疫及毒性效应分析。 本实验以黑鲷(Sparus macrocephlus)为研究对象,空腹3天后灌胃不同浓度(0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.8 mg/mL)的Scygonadin各100μL,以PBS为对照组,采集不同时间点(6h、12h、24 h、48 h、72 h)的血清及肝脏、肠道组织样品,测定超氧化物歧化酶(SOD)、脂质过氧化(MDA)、一氧化氮合酶(NOS)、一氧化氮(NO)、谷胱甘肽(GSH)等抗氧化指标。对高浓度组(0.8mg/mL),进一步检测髓过氧化物酶(MPO)、过氧化氢酶(CAT)、溶菌酶等免疫指标。实验结果表明黑鲷灌胃重组Scygonadin基因工程产物对其免疫及抗氧化指标无显著性影响,表明抗菌肽Scygonadin口服后不会影响机体的正常免疫功能,且对机体无毒害作用,具有安全性。 2、重组Scygonadin基因工程产物单次灌胃黑鲷吸收情况分析。 黑鲷单次灌胃抗菌肽Scygonadin(0.8 mg/mL)后,于30 min、60 min、90 min、3h、6h、12h、24 h取血清,肝、肠、胃、鳃、肾组织,提取组织总蛋白,WesternBlot方法检测血清及组织中Scygonadin蛋白吸收情况。实验结果表明单次灌胃血清及组织中各时间点均无法检测完整的Scygonadin蛋白吸收,表明Scygonadin可能属于缓慢吸收型抗菌肽分子。 3、重组Scygonadin基因工程产物长期灌胃黑鲷吸收情况分析。 在单次灌胃的基础上进一步开展长期灌胃实验,每天每尾鱼灌胃0.8 mg/mLScygonadin,取连续灌胃3天及7天血清及组织样品,提取组织总蛋白,WesternBlot方法检测血清及组织中Scygonadin蛋白吸收情况。实验结果表明在连续灌胃3天后鳃和肝中检测到完整Scygonadin吸收,而在连续灌胃7天后的组织中不能检测到完整的Scygonadin。初步实验结果证明抗菌肽Scygonadin可以完整的通过肠道黏膜屏障从而被机体吸收,并预示Scygonadin口服后在体内存在的时间可能少于7天。 4、重组Scygonadin基因工程产物对黑鲷头肾巨噬细胞功能影响研究。 用0.08 mg/mL和0.8 mg/mL抗菌肽Scygonadin与黑鲷头肾原代巨噬细胞共同孵育2h,表征细胞中活性氧含量的细胞荧光亮度与对照组相比均无显著性差异,实验结果说明Scygonadin并不刺激黑鲷头肾巨噬细胞活性氧的增加,在细胞水平上证明了Scygonadin在实际生产中应用的安全性。 该项研究初步结果表明,口服重组Scygonadin基因工程表达产物不会改变黑鲷的免疫状态,不产生活性氧等,因而具有安全性;同时,多次服用后可进入靶组织器官发挥潜在的功能,因而适于在水产养殖业中开发应用。