解没食子酸链球菌巴氏亚种(Streptococcus gallolyticus subsp.pasteurianus)即牛链球菌Ⅱ/2(Streptococcus bovis II/2),是一种重要的医院内传染病原,主要感染初生婴儿,致婴儿的脑膜炎、菌血症等,甚至死亡;多种动物也可以被解没食子酸链球菌巴氏亚种感染,且死亡率较高。2010年至2013年间,湖北及广西等地六个规模化鸭场~10日龄雏鸭突然发病,死亡率约20%。本研究从死亡雏鸭的脑、脾组织分离了六株细菌,经纯化培养后进行鉴定和动物回归试验,并以AL101002菌株为代表研究其致病机制,此外还对六株菌的大环内酯耐药机制进行了深入研究。研究结果如下:1.解没食子酸链球菌巴氏亚种的分离鉴定分离细菌纯化培养后,革兰氏染色呈阳性球菌,排列方式为单个或短链状,兰氏抗原分群鉴定为D群,生化特性鉴定为解没食子酸链球菌,结合16S r RNA基因测序结果,六株分离菌鉴定为解没食子酸链球菌巴氏亚种(S.gallolyticus subsp.pasteurianus),依次命名为AL101002、GX130304、GX130304、GX130630、GX130723、GX130809。采用颈部皮下途径分别感染上述六株菌,均可以致雏鸭死亡,发病症状、死亡率、病理变化等与自然感染相似。以AL101002为代表进行研究,石蜡切片革兰氏染色发现在感染雏鸭肝脏的肝窦及内皮细胞、脾脏的巨噬细胞、肾脏的肾小球内存在大量革兰氏阳性细菌,用针对AL101002的兔多克隆抗体进行免疫组织化学染色,证明存在于这些部位的细菌为解没食子酸链球菌巴氏亚种;雏鸭脾脏的超微组织学病理检测发现,在脾脏的巨噬细胞内可见复制状的球菌。综合上述结果,本研究分离到的六株菌为解没食子酸链球菌巴氏亚种。2.解没食子酸链球菌的致病机制以AL101002菌感染7日龄雏鸭,动态研究雏鸭发病机制:感染后5d,雏鸭表现出典型临床症状,发病率为100%,死亡率为52.38%(22/42)。AL101002菌株感染雏鸭后1-5d,各器官及血液均可以分离到接种菌,5d之后血液分离不到细菌,7d只有肾和法氏囊可以分离到细菌。剖检病理变化可见脾脏肿大、心包膜增厚,外观呈绒毛状,肝脏表面干酪样物质渗出,严重的脑膜充血。组织病理学变化为:感染后5d,脾脏基本结构消失,实质性心肌炎;感染后7d,法氏囊的淋巴细胞严重减少;感染后3-9d,脑膜炎症状程度不等;其他组织出现异嗜性粒细胞及单核巨噬细胞浸润。免疫器官指数测定,发现该菌对脾脏的影响最大。TUNEL法检测脾脏的细胞凋亡情况,结果表明感染组的脾脏细胞凋亡明显,且差异显著。感染雏鸭的超微组织学病理变化结果显示:感染后1-5d,脾脏巨噬细胞可见复制状球菌,并且在感染后5d,可见脾脏巨噬细胞坏死的特性;抗CD68抗体,一种巨噬细胞表面标记物,检测脾脏的巨噬细胞,结果表明在脾脏坏死灶周围可见阳性信号。荧光定量PCR检测脑组织的TNF-α、IL-1β及脾组织的Caspase-3、Caspase-8、RIPK1、RIPK2-like、MLKL、TNF-α,IL-1β、IL-6的变化,结果表明:脑组织的两个致炎因子表达上调,说明脑膜炎的发生;脾脏组织的两个关键凋亡因子基本无变化,相反坏死性凋亡关键调控因子RIPK1和MLKL在感染后5d分别上调表达~2.5倍,炎性因子IL-1β、IL-6上调表达显著,表明脾脏的急性炎症。由此可见解没食子酸链球菌巴氏亚种靶标雏鸭的免疫器官及脑,致雏鸭脾脏巨噬细胞的坏死性凋亡,可以侵入雏鸭的脑实质,致严重的脑膜炎症状。3.解没食子酸链球菌的耐药特征及大环内酯类耐药机制采用琼脂稀释法检测六株解没食子酸链球菌巴氏亚种的MIC值,结果表明六株菌均表现出多重耐药,尤其对大环内酯类药物呈现高水平耐药,红霉素与克拉霉素的MIC值分别高达1024 mg/L和512 mg/L。大环内酯耐药机制研究结果如下:A.未能检测到任何质粒、mef A或mef E基因,PAβN或CCCP外排泵抑制剂未能显著影响大环内酯MIC值,表明大环内酯耐药并非由外排系统所致;B.核糖体蛋白L4和L22无任何氨基酸的突变,23S r RNA序列上有点突变,而这些突变位点导致的大环内酯耐药MIC值￡32 mg/L,表明这些分离株中的大环内酯高水平耐药并非由核糖体蛋白L4和L22或23S r RNA突变导致;C.PCR检测到六株菌基因组上均有核糖体甲基化酶基因erm B和erm T,以及四环素耐药基因tet M和tet L,其中四株菌含有林可酰胺类耐药基因Lnua,一株菌含有庆大霉素耐药基因。对AL101002菌株进行了全基因组测序,并在此基础上扩增erm B及erm T基因的上下游序列,发现AL101002基因组含有两个耐药基因簇,分别长5.731 kb和11.244 kb,短基因簇含有erm B基因,长基因簇含有erm T,二者Genbank的登录号分别为KU511281和KU511280。D.erm B与erm T在六株菌的诱导表达:Western blot检测六株菌的红霉素耐药甲基化酶Erm B和Erm T在红霉素存在与否时的表达,结果表明在红霉素存在时,两个红霉素耐药甲基化酶在六株菌中均可表达,当红霉素不存在时,六株菌均不表达这两个甲基化酶;进一步在E.coli里检测含有His标签的这两个甲基化酶融合蛋白的表达,结果表明添加一定量的红霉素,两个甲基化酶均可以表达,红霉素不存在时,Erm B和Erm T表现出有少量表达,可能是和启动子的泄漏有关。E.erm B和erm T对大环内酯高水平耐药的贡献:测两个耐药基因共存和单独存在时对大环内酯类药物的耐药贡献,结果表明,二者共存时,无论有无前导肽(leader peptide),所有测试的大环内酯药物的MIC值都高于单独存在时的MIC值。无论二者共存还是单独表达,无leader peptide时的MIC值都是是含leader peptide时的两倍,且二者共存并有leader pepetide时的MIC值与六株临床分离株的大环内酯MIC值相当;说明六株菌的大环内酯高水平耐药是由erm B和erm T基因共存导致,且leader peptide对其下游的erm基因具有衰减调控的作用。综合上述研究结果,本论文得到的结论如下:A.首次从雏鸭的脑及脾脏组织分离并鉴定了六株解没食子酸链球菌巴氏亚种,发现解没食子酸链球菌巴氏亚种可导致雏鸭脑膜炎及脾脏巨噬细胞坏死性凋亡,并可导致较高的雏鸭死亡率。B.首次发现解没食子酸链球菌巴氏亚种基因组含有红霉素耐药基因核糖体甲基化酶erm B和erm T,并发现二者受红霉素诱导表达,且二者的诱导表达是导致六株解没食子酸链球菌巴氏亚种分离株大环内酯高水平耐药的主要原因。本论文的研究结果为该类细菌的临床诊断、耐药监控、临床用药以及抗菌药物的研发提供了重要的理论依据。