背景阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种与年龄相关的神经系统退行性疾病,也是造成人类死亡的第六大常见原因。虽然目前已有大量的基础研究及临床前实验探讨其致病机制及潜在治疗靶点,但目前仍缺乏安全有效的治疗策略。近年来,间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)移植成为治疗AD的一种有前景的治疗方法。然而,移植的MSCs在AD脑组织微环境中增殖能力差、存活率低,限制了其治疗效果。Lin28B是一种高度保守的RNA结合蛋白,可促进多种干细胞的自我更新和存活能力,但目前对lin28B是否能促进移植的MSCs在AD中的存活尚无研究。目的探讨lin28B是否可促进移植的MSCs的存活,使之能够在AD脑组织微环境内长期存活并发挥神经保护作用。材料与方法1.从6周龄C57BL/6J雄性小鼠股骨中提取MSCs,利用全骨髓培养法分离培养MSCs,留取4-10代MSCs备用。2.构建lin28B过表达慢病毒载体和空病毒载体,并转染至MSCs中。将MSCs分为三组:lin28B MSCs(lin28B 过表达 MSCs 组)、vector MSCs(载体 MSCs组)和 control MSCs(对照 MSCs 组)。qRT-PCR 检测各组细胞 lin28B mRNA的表达,western-blot检测各组细胞中lin28B蛋白的表达。3.用CCK8试剂盒及流式分析法检测lin28B对MSCs增殖能力的影响;用划痕实验、transwell实验检测其对MSCs迁移能力的影响。4.Aβ1-42处理各组MSCs 48h,Annexin V/APC染色后比较各组细胞凋亡情况;Western blot 检测各组细胞 caspase 3,cleaved caspase 3 的表达差异。5.Western blot检测各组MSCs中IGF-2蛋白表达水平,后用siRNA下调IGF-2的表达,观察其对MSCs增殖、迁移及对Aβ1-42处理后MSCs凋亡能力的影响。6.将 lin28B MSCs、vector MSCs 和 control MSCs 分别注入 10 月龄 APP/PS1 雄性小鼠侧脑室中。小鼠被分成5组:未处理组APP/PS1小鼠,PBS+APP/PS1小鼠,control MSCs+APP/PS1 小鼠,lin28B MSCs+APP/PS1 小鼠,vector MSCs+APP/PS1 小鼠。7.采用小动物活体成像技术在MSCs移植后3d,7d,10d,14d,21d和28d观察lin28B MSCs和vector MSCs在APP/PS1小鼠体内存活情况。8.在移植MSCs后第30-35天,通过Morries水迷宫实验记录各组小鼠寻找平台所用时间、穿越平台次数及在目标象限停留时间。9.处死动物,并对其脑组织切片进行免疫荧光染色分析。用硫磺素染色检测评估脑组织内淀粉样斑块沉积;用TUNEL试剂盒检测脑组织内细胞凋亡;用Iba-1抗体检测脑组织内小胶质细胞的活化。结果1.在体外上调MSCs中lin28B蛋白表达水平后,lin 28B MSCs的增殖和迁移能力较 control MSCs 组和 vector MSCs 组增强;经 Aβ1-42 处理后,lin28B MSCs凋亡细胞比例较其余两组少,caspase 3,cleaved caspase 3蛋白表达水平较其余两组低。2.上调MSCs中lin28B蛋白表达水平后,IGF-2蛋白在lin28B MSCs中高表达。用siRNA敲低IGF-2表达后,lin28B MSCs的增殖、迁移、抗凋亡能力明显减弱。3.体内活体成像显示lin28B MSCs移植后,在APP/PS1小鼠脑内增殖及存活能力较vector MSCs增强。4.Morris水迷宫实验结果示lin28B MSCs移植组小鼠寻找平台所用时间最短,穿越平台次数最多及在目标象限时间最长。5.免疫组织荧光技术检测到lin28B MSCs组小鼠、vector MSCs组小鼠和control MSCs组小鼠较PBS组及未处理组小鼠的脑组织中Aβ沉积减少,脑细胞凋亡减少,活化小胶质细胞比例减少;其中lin28B MSCs组小鼠上述指标改变最为显著。结论1.在体外实验中lin28B通过调控IGF-2表达促进MSCs增殖、迁移,抑制Aβ1-42诱导的细胞凋亡。2.在体内,lin28B MSCs可显著提高APP/PS1小鼠的学习记忆能力,减少Aβ斑块形成、小胶质细胞活化及细胞凋亡,对APP/PS1小鼠具有神经保护作用。