目的:化学疗法目前仍是治疗恶性肿瘤的主要手段。近年来,随着化疗-免疫疗法的提出,肿瘤细胞免疫原性死亡(ICD)的概念开始被人们熟知。其能有效促进肿瘤细胞释放肿瘤相关性抗原(TAAs)及多种细胞因子,促进抗原提呈细胞的提成效率,从而更大程度的激活细胞毒性T细胞(CTLs),从而产生免疫治疗作用。但单纯化疗诱导的免疫应答受到肿瘤免疫抑制微环境(ITME)的极大限制,并不能达到令人满意的治疗效果。肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)是ITME中主要的免疫抑制细胞,将TAMs从M2表型逆转为M1表型,有利于消除TME的免疫抑制,从而增强免疫治疗的整体效果。但目前的化学-免疫疗法大都是无差别的对化疗药物和免疫调节剂进行递送,化疗药物在杀死肿瘤的同时破坏免疫微环境,损害有益的免疫细胞。同时,肿瘤微环境的正常免疫细胞受损后,会募集更多的免疫抑制性细胞,加重ITME。基于此,我们构建了一种可拆卸的双靶向核壳型纳米粒用于增强肿瘤化学免疫治疗。方法:(1)纳米系统的构建与表征 首先我们利用具有肿瘤靶向性的透明质酸(HA)和化疗药阿霉素(DOX)合成HA-DOX大分子前药。随后将前药与肽段GPLGLAGC(一种基质金属蛋白酶-2(MMP-2)响应断裂肽段)连接形成CGALGLPG-HA-DOX。然后,将 M2-TAMs 靶向肽(M2pep)和GPLGLAGC-HA-DOX分别与白蛋白连接,形成两个嵌段:HSA-M2pep(HM2)和HSA-CGALGLPG-HA-DOX(HMHD)。最后,在两个嵌段在偶联过程中载入氯喹(CQ),形成最终制剂HMHD/HM2-CQ。分别使用紫外光谱和核磁共振氢谱、激光粒度分析仪及透射电镜(TEM)等手段对给药系统进行表征。(2)体外释药特性研究 采用高效液相色谱(HPLC)和TEM研究了该给药系统对MMP-2酶的响应。结果表明,在MMP-2酶的作用下,体系可分为HA-DOX和HM2-CQ。此外研究了在MMP-2酶和不同pH条件下DOX和CQ的体外释放情况。(3)体外免疫原性和复极化研究 采用荧光显微镜及流式细胞仪进行细胞摄取实验,分别考察了可拆卸核壳纳米系统内核和外壳对巨噬细胞和4T1细胞的靶向能力。ELISA试剂盒,流式细胞仪分析HM2-CQ对M2表型重塑的情况;此外,采用MTT法研究空白载体的生物相容性及递送系统对4T1细胞的抑制作用;使用划痕实验对纳米系统的抗转移能力进行考察。(4)体内靶向性及抗肿瘤活性研究 通过小鼠活体荧光成像仪研究使用游离IR783及HMHD/HM2-IR783 NPs标记的小鼠体内IR783的组织分布情况;建立荷4T1乳腺癌的BALB/c雌性小鼠动物模型,利用小鼠瘤体积,体重,生存曲线的变化、HE染色病理切片等结果考察纳米递送系统的抗肿瘤活性。建立荷4T1乳腺癌的BALB/c雌性小鼠肺转移动物模型,以肺组织转移结节数量为指标,研究纳米系统在体内抗转移作用。(5)体内免疫应答研究 建立荷4T1乳腺癌的BALB/c雌性小鼠动物模型,通过体内细胞因子检测,流式细胞仪检测个细胞免疫指标,免疫荧光切片等验证纳米药物递送系统能够有效激活小鼠体内的免疫应答。结果:实验结果表明,HMHD/HM2-CQNPs形貌为核壳状球形,粒径约为180 nm,电位约为-27 mV。酶响应能力结果证明:该可拆卸纳米系统可响应MMP-2酶而分离为HA-DOX前药外壳和HM2-CQ内核。体外释药结果表明,与正常生理条件相比,在MMP-2酶和酸性条件下可拆卸纳米系统的药物更易释放。此外,体外细胞实验表明HMHD/HM2-CQNPs分别通过癌细胞表面的CD44受体和M2pep靶向其各自的靶细胞,使化疗药物精确进入肿瘤细胞,避免其对巨噬细胞的损伤,而免疫调节剂精确进入巨噬细胞,有效调节ITME;体外对CRT和转型等研究表明HMHD/HM2-CQ NPs能够成功诱导ICD并使M2-TAMs转型成M1型巨噬细胞。体内活体成像结果显示,该系统在明显积累在肿瘤组织,说明其具有较强的肿瘤靶向性。体内药效学和抗转移结果表明HMHD/HM2-CQ NPs可以有效抑制肿瘤生长及转移。另一方面,体外免疫应答研究的实验结果也显示HMHD/HM2-CQNPs可有效的激活小鼠体内免疫应答。结论:在本研究中,我们开发了一种精准的双向靶向联合给药策略。该策略通过向TAMs和肿瘤细胞分别精准给药,能够有效改善免疫抑制肿瘤微环境,促进细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)的募集,抑制肿瘤生长和肿瘤转移,延长荷瘤小鼠的生存期。与传统的同时、不加区分地将有效载荷传递给一种细胞的共递送系统相比,利用肿瘤微环境中不同的分布特征,将多种治疗药物分别传递给肿瘤细胞和其他靶细胞,可能是一种优化化疗和免疫联合治疗疗效的新策略。