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目的：AMP激活的蛋白激酶(AMPK)是调节细胞能量状态的蛋白激酶级联反应中的中枢组成部分,激活的AMPK可激发一系列的反应来恢复细胞内的能量平衡,启动分解代谢途径,如脂肪酸氧化和糖酵解,从而增加ATP的产生,同时关闭合成代谢途径,如脂肪酸合成和蛋白合成,减少ATP的消耗。激活AMPK可以减少心肌缺血再灌注损伤和心肌细胞的凋亡。吗啡是一种外源性阿片受体激动剂,已有实验证实吗啡具有心肌保护作用,但是其机制并未完全阐明。目前还不清楚AMPK是否参与了吗啡的心肌保护作用。我们采用离体大鼠心脏灌注制备缺血再灌注模型,检测吗啡预处理是否可以激活AMPK,以及AMPK是否参与了吗啡预处理的心肌保护作用。
方法：实验分为两个方案。实验方案一:离体大鼠心脏K-H液平衡灌注15分钟待心脏稳定以后用含有不同浓度吗啡的K-H液灌流15分钟,取心肌组织提取蛋白做Western blot检测。分为4个组,control组(morphine 0M)、morphine预处理组(morphine10-7M)、morphine预处理组(morphine10-6M)、morphine预处理组(morphine10-5M)。实验方案二:离体大鼠心脏K_H液平衡灌注15分钟再进行预处理15分钟,然后心脏30分钟停灌模拟缺血,60分钟再灌注。大鼠心脏分为8组,分别为:对照组、compound C(AMPK的抑制剂)组、STO609(CaMKKβ抑制剂)组、BAPTA-AM(细胞内钙螯合剂)组、morphine预处理组、morphine+compoundC组、morphine+ST0609组、morphine+BAPTA-AM组。观察并分析左室发展压(LVDP)、左心室收缩及舒张压力最大变化速率(±dp/dtmox)、心率(HR)。用氯化三苯基四氮唑染色法(TTC)染色法确定心肌梗死区面积。复灌60min后取左心室组织石蜡包埋切片,将标本进行TUNEL染色,计算凋亡指数(A1)。在心脏再灌注60min期间收集心脏灌出液进行肌酸激酶释放的检测。应用Westernblot技术检测各处理组心肌组织AMPK的磷酸化变化。
结果：实验方案一:Western blot检测显示吗啡增加了AMPK的磷酸化水平,并呈剂量依赖性。实验方案二:吗啡预处理促进了再灌注期间心功能的恢复,减少了心肌梗塞面积(IS/AAR从63±7％到40±5％)和肌酸激酶释放(从319±46到156±42 IU/60min/gdw),减少了凋亡指数(从16±2％到5±1.4％)。而compound C抑制了吗啡引起的AMPK的磷酸化及心肌保护作用(心功能恢复、梗塞面积减少(58±6％)、肌酸激酶释放加增(270±40 IU/60min/gdw)、凋亡增加(13±1.5％))。STO609抑制了吗啡的心肌保护作用,抑制了吗啡引起的AMPK的磷酸化。BAPTA-AM抑制了吗啡的心肌保护作用,抑制了吗啡引起的AMPK的磷酸化。
结论：吗啡可以通过Ca2+-CaMKKβ依赖的信号转导途径激活AMPK,AMPK参与了吗啡预处理对心肌缺血再灌注损伤的保护作用。