【研究背景和目的】转移是胃癌患者死亡的主要原因,但是我们对胃癌转移的调控网络仍知之有限。胃癌的侵袭转移机制一直是胃癌研究中的热点,它涉及多个基因、多条信号通路的交互作用。研究发现那些调控、连接胃癌转移的多条信号通路的关节点,对于理解胃癌转移的分子机制,开发胃癌转移治疗的靶向药物具有重要意义。转录因子可参与多种信号通路的调控。研究表明转录因子既可以作为癌基因又可以作为抑癌基因发挥作用,然而它们在胃癌转移中的作用至今仍不清楚。我们发现了一个在其他类型肿瘤发生发展中起重要作用的转录因子POU2F2,在胃癌的侵袭转移中起着重要作用。我们发现POU2F2在有转移的胃癌中呈高表达,但其在胃癌中异常表达的原因、意义、功能和调控机制都不清楚。【方法】1.用WB的方法检测POU2F2在正常胃上皮细胞及不同转移能力的胃癌细胞系中的表达。进一步用免疫组化的方法检测并分析了有转移和无转移的胃癌及配对癌旁组织中POU2F2的表达,并分析POU2F2的表达与胃癌预后的关系。2.通过调控POU2F2表达,在体外及体内分别验证POU2F2在胃癌侵袭转移中的作用。采用生物信息学方法预测POU2F2下游可能的结合位点,并通过CHIP-Seq,EMSA以及双荧光素酶报告基因实验进行验证。并在功能学水平进一步验证其对胃癌转移的影响。3.通过文献回顾,筛选POU2F2上游潜在作用的靶基因。再次通过生物信息学方法预测该靶基因与POU2F2启动子区的可能结合位点。通过CHIP-Seq,EMSA以及双荧光素酶报告基因实验验证其相互作用。并且通过调控POU2F2和ROBO1的表达,分别在体外及体内检测该信号通路对胃癌侵袭转移的作用。4.使用双荧光素酶报告基因实验验证miR-218对NF-κB/POU2F2/SLIT2/ROBO1信号通路多个位点的调控,进而在功能学上检测其对胃癌侵袭转移的作用。【结果】1.POU2F2蛋白在正常胃粘膜细胞系GES-1中几乎不表达。与GES-1细胞相比,虽然低转移潜能的胃癌细胞(MKN28-NM,SGC7901-NM)中的POU2F2蛋白升高了2倍,但在高转移胃癌细胞系SGC7901-M,MKN28-M中POU2F2的表达升高了约9倍。癌旁组织中POU2F2表达的阳性率为4.00%;胃癌组织中,POU2F2表达的阳性率为65.52%,然而仅有6.00%无淋巴结及远处转移的胃癌组织中POU2F2表达阳性,而84.97%转移性胃癌组织POU2F2表达阳性。POU2F2在胃癌中表达高于癌旁组织者其肿瘤淋巴结和远处转移率高,TNM分期较晚,患者生存期更短。2.转染POU2F2 shRNA的SGC7901-M细胞体外迁移、侵袭能力分别下降。裸鼠尾静脉注射肺转移实验中,感染POU2F2 shRNA的SGC7901-M细胞在裸鼠的肺转移灶明显减少。同时转染POU2F2慢病毒表达载体可恢复细胞的高转移能力。生物信息学预测ROBO1为POU2F2可能的下游结合位点。CHIP-Seq,EMSA以及双荧光素酶报告基因实验进一步证实POU2F2与ROBO1基因的启动子区相结合。体内及体外功能学实验分别显示POU2F2通过ROBO1促进胃癌的侵袭转移。3.文献回顾提示POU2F2可能是NF-κB的下游靶基因。通过生物信息学预测,并结合CHIP-Seq,EMSA以及双荧光素酶报告基因实验证实了NF-κB与POU2F2基因启动子区的结合。激活NF-κB可增加POU2F2和ROBO1的表达并在体内外均促进胃癌细胞的转移。抑制NF-κB的活性可看到相反的表型。在NF-κB激活的条件下,下调POU2F2的表达可降低ROBO1的表达水平并使胃癌细胞体内外的转移能力随之减低。用shPOU2F2敲除POU2F2后,再过表达ROBO1可使胃癌细胞恢复体内外的转移能力。4.双荧光素酶报告基因实验表明miR-218可直接结合并同时调控POU2F2,IκK-β和ROBO1。体内外功能学实验显示上调miR-218可抑制POU2F2,IκK-β和ROBO1的表达,并抑制胃癌细胞的转移能力;相反,下调miR-218可引起POU2F2,IκK-β和ROBO1的表达增高,促进胃癌细胞的转移。于此同时,抑制POU2F2,IκK-β和ROBO1其中任一个的表达可看到类似miR-218过表达的表型;然而通过转染不含有miR-218结合位点的载体来过表达IKK-β,POU2F2和ROBO1,可部分逆转因过表达miR-218而产生的抑制胃癌转移的表型。【结论】1.POU2F2通过正性调控ROBO1促进胃癌的侵袭和转移。POU2F2阳性表达的胃癌患者总体生存期更短,预后更差。2.胃癌转移中NF-κB及SLIT2/ROBO1信号通路通过POU2F2交互作用,形成以POU2F2为中心相互作用网络:NF-κB/POU2F2/SLIT2/ROBO1。3.miR-218通过同时抑制NF-κB/POU2F2/SLIT2/ROBO1信号通路上多个靶点,阻止胃癌转移。